基于Pd/g-C3N4-SWCNTs的雌二醇电化学传感器构建及应用研究

郑志祥，王 玫，李 江，宫 雪，王春明

(1.甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室，甘肃政法学院，甘肃 兰州 730070；2.宁夏医科大学药学院,宁夏 银川 750004；3.兰州大学 化学与化工学院，甘肃 兰州 730000)

内分泌干扰物(EDCs) 是一种可以干扰人体和动物的内分泌系统的外源性化学物质，现已引起各界的广泛关注。EDCs可以破坏人体内激素平衡，直接威胁人类的生存。2002年签署的《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》中，首批确定具有持久性污染的12种环境激素之一就是雌二醇(E2)。E2是雌效应最强的天然甾体雌激素，在很低浓度下(0.1 ng/L)即可表现出极强的生物效应[1-2]。E2可通过食物链在生态系统中进行生物富集，并蓄积在机体脂肪组织内[3]，造成人体脏器损害，并诱发乳腺癌、前列腺癌、生殖障碍等疾病[4-5]。因此，E2被欧盟水框架指令列为优先控制的污染物之一[6]。然而，仍有一些养殖场为了经济效益而违规使用激素等促进生长的添加剂以提高养殖效率和畜禽瘦肉比[7]，加剧了E2在人体和生物体内的富集及对生态环境的破坏作用。为了跟踪和监控E2的污染程度，迫切需要建立灵敏、快速、低成本的测定方法。目前测定E2的方法主要有液相色谱法[8]、液相色谱-质谱联用法[9]、气相色谱-质联用法[10]等，但这些方法往往需要对样品进行预处理、耗费时间且仪器昂贵。与上述方法相比，电化学检测方法因其灵敏度高、仪器简单、反应速度快、成本低等特点在环境分析中备受关注。然而，E2在裸玻碳电极上的氧化还原信号较弱，为了改善E2在电极表面的电催化活性和抗干扰能力，已有各种材料用于电极的修饰，并将其用于E2的电化学检测。如Song等[11]采用聚丝氨酸修饰玻碳电极用于E2的检测，Han等[12]采用新型磁性分子印迹传感膜材料制备修饰电极用于E2的检测。

在众多功能化材料中，氮化碳由于具有丰富的π电子而备受关注。其中，作为氮化碳5种同素异形结构[13]之一的类石墨相氮化碳(g-C3N4)，由于其优异的电催化性能而引起了人们的特别关注。g-C3N4作为一种新型非金属半导体材料，因具有电子传递速率快、比表面积大、热导率高、化学稳定性好、载荷子迁移率高等优点，而在电化学领域具有潜在的应用前景[14-16]。为了进一步提高g-C3N4的催化性能和导电性能，可通过在其表面修饰金属或者非金属纳米材料，如Cu[17]、Fe[18]、Pt[19]、AgNi[20]、氧化石墨烯[21]、碳纳米管(CNTs)[22]等实现信号放大作用。其中CNTs具有丰富的离域π键结构、独特的电子学性能、良好的吸附能力和导电性能、较大的比表面积和长径比及较多的催化活性位点[23-25]。已有文献报道了g-C3N4-CNTs复合材料的制备及其在太阳能电池中的应用[26-27]。然而，通过固体研磨-热聚合法制备g-C3N4-SWCNTs复合材料并用于E2的电化学检测未见报道。

本文利用三聚氰胺(MAM)和单壁碳纳米管(SWCNTs)为前体通过固体研磨-热聚合法制备了g-C3N4-SWCNTs复合材料，然后负载Pd纳米粒子合成Pd/g-C3N4-SWCNTs复合材料，并将其用于E2的电化学检测。实验结果表明，Pd/g-C3N4-SWCNTs纳米复合材料对E2的电化学氧化具有良好的催化作用，可用于构建电分析检测E2的新型传感材料，并有望用于实际饲料样品中E2的快速检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

雌二醇(E2)、Na2PdCl4购于Aladdin 公司，单壁碳纳米管(SWCNTs)购于深圳市碳纳米港，三聚氰胺(MAM)及其他试剂均购于天津市光复精细化工研究所;所有试剂均为分析纯，除碳纳米管之外，其他试剂在使用前均未进行纯化处理；所有溶液均使用二次去离子水进行配制；所有电化学测试前均通氮气除氧5 min。200KV/JEM-2010(HR)透射电子显微镜(日本电子公司)，TENEOR 37红外光谱仪(德国布鲁克公司)，D/max-2400型X衍射分析仪(日本理学公司)，Agilent 1220 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。

1.2 g-C3N4-SWCNTs的制备

取0.12 g羧基化处理的单壁碳纳米管和2.50 g 三聚氰胺置于玛瑙研钵中研磨1.5 h，再将混合物置于石英坩埚中，用铝塑包封，以5 ℃/min升温至520 ℃保持4.0 h，再以5 ℃/min降至室温，得到g-C3N4-SWCNTs复合材料，制备过程如图1所示。其他不同比例的复合物的制备方法同上。

图1 g-C3N4-SWCNTs复合材料的合成示意图Fig.1 Schematic illustration of the synthetic procedure for g-C3N4-SWCNTs

1.3 Pd/g-C3N4-SWCNTs的制备

1.4 Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE的制备

将玻碳电极在金相砂纸上用1.0 μm和0.05 μm的Al2O3粉末抛光成镜面，依次在丙酮、水中超声清洗后，将处理好的玻碳电极于室温下自然晾干。取Pd/g-C3N4-SWCNTs粉末加入水超声分散，得到1 mg/mL的分散液。取8 μL上述的分散液滴涂于处理好的电极表面(其8 μL用量是基于5.0 m mol/L[Fe(CN)6]3-/4-作为探针进行电化学测试得到的最优用量)，在室温条件下晾干备用。

1.5 DPV法与HPLC法测定E2方法学上的显著性差异比较

为进一步验证该传感器的潜在使用价值，采用高效液相色谱法测定样品中E2含量进行对照，并运用SPSS19.0进行两种方法的统计分析，以比较二者在方法学上是否存在显著性差异。其中HPLC的色谱条件为：色谱柱：TOSOH TSKgel-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：45%乙腈-55%水；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm。样品处理：称取鸡饲料样品5.0 g，准确加入25 mL乙醇浸泡24 h，取其上清液以 5 000 r/min的速度离心5 min，用0.22 μm滤膜过滤后备用。

2 结果与讨论

2.1 复合材料的形貌及结构表征

图2为g-C3N4-SWCNTs和Pd/g-C3N4-SWCNTs的表面形貌图。从g-C3N4-SWCNTs的SEM图中可观察到许多丝绸样层状纳米片状结构(图2A)，表明SWCNTs并未影响g-C3N4的结构。g-C3N4-SWCNTs的TEM图中可观察到其柔纱状薄片结构，同时还可观察到SWCNTs分散在g-C3N4的表面(图2B)。Pd/g-C3N4-SWCNTs的SEM(图2C)和TEM(图2D)图均表明，Pd纳米粒子已均匀地分散在g-C3N4-SWCNTs复合材料表面。

考察了SWCNTs、g-C3N4、g-C3N4-SWCNTs和Pd/g-C3N4-SWCNTs的XRD衍射光谱(图3A)。从图3A可知，碳纳米管有两处衍射峰，分别位于26.4°和47.3°处，衍射峰对应于六角形石墨结构的(002)和(100)晶面[29]；纯g-C3N4样品有2个明显的衍射峰位于13.0°和27.3°处，分别对应于g-C3N4(JCPDS 87-1526)卡片中的(100)和(002)衍射面，属于石墨相晶系，其中位于13.0°处的特征峰属于Melon类物质的特征峰，位于27.3°的特征峰为芳香类化合物典型的层间堆垛峰。这两处衍射峰与文献报道的g-C3N4相一致[30]。然而，在g-C3N4-SWCNTs复合材料中无明显的SWCNTs衍射峰，可能因为负载的SWCNTs量较少。而Pd/g-C3N4-SWCNTs复合材料可观察到在40.1°、47.3°和68.3°处多了3个衍射峰，其分别对应于面心立方体晶体结构的(111)、(200)和(220)晶面，为Pd粒子的衍射峰。

2.2 Pd/g-C3N4-SWCNTs的电化学行为表征

对比g-C3N4/GCE、g-C3N4-SWCNTs/GCE及Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE在5.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl中的循环伏安行为。结果表明，与g-C3N4和g-C3N4-SWCNTs修饰电极相比，探针分子在Pd/g-C3N4-SWCNTs修饰电极上的催化氧化反应峰电流有一定程度增大。由此表明Pd/g-C3N4-SWCNTs能有效地提高电极表面与探针分子[Fe(CN)6]3-/4之间的电子转移速率。这可能归因于Pd纳米粒子和SWCNTs的良好催化性能和导电性能，而g-C3N4-SWCNTs复合材料独特的电子特性则为其提供了更多的活性位点，从而增加了电子传导速率和催化性能。

2.3 E2在Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE上的电化学行为

在PBS(pH 2.5)中，采用循环伏安法研究了4种不同电极(g-C3N4/GCE、g-C3N4-SWCNTs/GCE、Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE、GCE)对E2的电化学行为。Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE在不含E2的空白支持电解质中无明显响应，在含有0.5 mmol/L的E2溶液中，4种不同电极均呈现一个明显的氧化峰，表明修饰电极对E2具有良好的电催化作用。E2在g-C3N4/GCE、g-C3N4-SWCNTs/GCE、Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE上的响应电流分别为1.58、2.12、2.78 μA，其中E2在Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE上的响应电流明显大于在g-C3N4/GCE、g-C3N4-SWCNTs/GCE上的响应电流，这可能归因于Pd纳米粒子和SWCNTs良好的催化性能和导电性能，而g-C3N4-SWCNTs复合材料独特的电子特性则为其提供了更多的活性位点，从而增加了电子传导速率和催化性能。以上结果表明，Pd/g-C3N4-SWCNTs复合材料提高了电极表面的电催化能力和电子传递能力，与“2.2”结果一致。

2.4 扫描速率的影响

电极反应动力学可以通过扫描速率对氧化峰电流的影响来表征。图4A为Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE修饰电极在E2溶液中于不同扫描速率下氧化峰电流的变化。结果显示，在扫描速率20～100 mV/s范围内，E2的氧化峰电流随着扫描速率的增加而增大，且其氧化峰电流与扫描速度的平方根成正比，其线性方程为：Ipa(μA)=0.372+0.324ν1/2(mV/s)，r=0.994(图4A插图)。实验结果表明，E2在Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE上的电极过程为扩散控制过程。

2.5 pH值的影响

考察了不同pH值支持电解质溶液对E2电化学行为的影响。在pH 2.5～10.5的PBS中，E2在Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE上的循环伏安行为如图4B所示。由图可知，在此pH范围内，E2的氧化峰电位随着溶液pH值的增加而负移，表明质子参与了雌二醇的电化学氧化过程，且溶液pH值与E2的氧化峰电位间呈现良好的线性关系，其线性方程为：Epa(V)=1.041-0.060 pH，r=0.996。方程的斜率为-60 mV/pH，接近理论值-59 mV/pH，表明雌二醇在Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE上的电催化氧化过程为等电子等质子过程，其转移数为1[33]。从图4B插图还可以看出，氧化峰电流的最大值出现在pH 2.5处。因此，实验选择pH 2.5的0.1 mol/L PBS作为体系的支持电解液。

2.6 示差脉冲法测定E2

采用示差脉冲法(DPV)对鸡饲料和猪饲料两种基质样中的E2含量进行测定。结果如图5A所示，随着E2浓度的不断增大，E2在0.80 V处的氧化峰电流随之增大，且氧化峰电流大小与两种基质中的E2浓度均在5～150 μmol/L范围内呈良好的线性关系，其线性方程为：Ipa(μA)=0.834 7+0.007 0CE2(r=0.990)，检出限(S/N=3)为1.7 μmol/L。采用DPV法对50 μmol/L的E2进行10次连续测定，氧化峰电流的相对标准偏差(RSD)为3.2%，表明该修饰电极对E2测定具有良好的重现性。将该电极放置于4 ℃条件下保存3周后，E2在修饰电极上的氧化峰电流降至初始值的93.8%，表明该修饰电极具有良好的稳定性。

2.7 干扰研究

2.8 分析应用

本文选择饲料为样品，以考察该传感器在实际生产中应用的可能性。分别取20.0 g鸡饲料和猪饲料，加至100 mL乙醇中浸泡24 h，取上清液过滤后备用。采用标准加入法进行加标回收率测定，每个浓度平行测定5次，测得其加标回收率为98.6%～107%，相对标准偏差(RSD)为1.3%～3.3%(见表1)。将本方法与文献方法进行比较，结果如表2所示。结果表明，本传感器用于实际饲料样品中E2检测时，其线性范围更宽，且无需对样品进行复杂的前处理。

表1 饲料样品中E2的检测结果(n=5)

表2 本方法与文献检测结果的比较Table 2 Performance comparison of the proposal sensor for E2 detection with the other reported sensors

BPIDS:1-butyl-3-[3-(N-pyrrolyl)propyl] imidazoliumdodecyl sulfate/ glassy carbon electrode;Fe3O4-MIP/SPCE:Fe3O4-magnetic molecularly imprinted polymer/screen printed carbon electrode;RGO-DHP:reduced graphene oxide-dihexadecylphosphate/glassy carbon electrode

2.9 DPV法与HPLC法测定E2方法学上的显著性差异比较

为了进一步验证该传感器的潜在使用价值，本文采用高效液相色谱法对样品中E2的含量进行测定。在优化色谱条件下，以E2的浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得到E2的线性方程为：y=146 984x-51 270(r=0.999 9)，线性范围为3.4～54.4 mg/L(12.5～200 μmol/L)。分别称取阴性猪饲料和鸡饲料各5.0 g，共6份，分别准确加入浓度为272 mg/L的E2对照品溶液55.0 μL和50.0μL，各3份，对样品进行前处理，测定E2含量，计算其回收率，并将其测定结果与本文所建立的方法进行对比，结果如表 3所示。从表中可看出，两种方法用于饲料样品中E2检测时的回收率和RSD差别在方法学误差的范围内。

表3 饲料样品中雌二醇的检测结果Table 3 Determination results of E2 in the feedstuff samples

运用SPSS19.0对DPV法与HPLC法测定雌二醇的检测结果进行统计分析。数据结果表明，通过F检验测得的P值为0.120(大于0.05)，说明方差齐；t检验测得的P值为0.975(大于0.05)，说明两种方法测定结果的均值无显著性差异。由此表明Pd/g-C3N4-CNTs纳米复合材料作为一种新型的催化材料所构建的电化学传感器可用于实际样品中E2的检测。

3 结 论

本文采用固体研磨-热聚合法制备了新型的g-C3N4-SWCNTs复合材料，利用自组装法负载金属Pd纳米粒子，进而制备了新型电化学传感器Pd/g-C3N4-SWCNTs/GCE，并将该传感器用于饲料样品中E2的分析检测。研究发现Pd/g-C3N4-SWCNTs复合材料可有效提高电子传递速率和电导率，且对E2具有响应迅速、灵敏度高、选择性好和线性范围宽等优点。同时，该传感器与HPLC对E2分析检测时，在方法学上无显著性差异。因此，Pd/g-C3N4-SWCNTs电化学传感器有望用于食品、水体及饲料等中环境激素类污染物的检测。