子痫前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞和雌三醇变化及相关性分析*

李 颖，丁 渊，陈丽丽，许 浩

(浙江省杭州市第一人民医院中医科 310006)

世界范围内孕妇出现子痫前期的比例为5%～20%，高龄偏胖的孕妇、有家族遗传史的孕妇及自身合并内科疾病的孕妇为好发群体，发病与遗传、环境等多种因素相关[1]。该病对母体及胎儿的危害较大，严重者危及生命，临床上一般通过规范产检来提前诊断，也可在孕早期补充钙剂有效预防。免疫耐受是子痫前期发病机制之一，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在机体的免疫耐受中起重要作用，同时有学者在体外试验中发现，雌激素可促进Foxp3的表达[2]。本研究针对子痫前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞和雌三醇变化进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2017年7月本院就诊的50例子痫前期患者。纳入标准：(1)符合子痫前期的诊断标准[3]；(2)初产妇，且无相关产科并发症；(3)心、肝、肾等器官无重大疾病；(4)无血液系统疾病及免疫治疗史；(5)所有患者对本次研究知情并签署同意书。根据病情不同将患者分为轻度子痫前期组(24例)和重度子痫前期组(26例)，轻度子痫前期组平均年龄(30.16±4.57)岁，平均孕周(36.15±4.09)周；重度子痫前期组平均年龄(31.25±5.21)岁，平均孕周(35.69±4.97)周；选取同期健康孕妇25例为对照组，平均年龄(30.67±4.39)岁，平均孕周(35.98±4.43)周。3组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1试验方法 所有患者入组后第2天晨起抽取空腹肘静脉血5 mL，Treg流式检测步骤如下：(1)提取，使用淋巴细胞分离液制备外周血单个核细胞(PBMCs)；(2)洗涤，使用PBS洗涤后制备PBMCs悬液；(3)染色，首先进行细胞表面染色，将3 mL磷酸盐缓冲液(PBS)滴加至200 μL 外周血PBMCs悬液中，1 500 r/min离心5 min后去除上清液，再将15 μL的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD4抗体和藻红蛋白(PE)标记的CD25抗体滴加至500 μL PBS重悬稀释到1×106个/mL的细胞中。室温下避光30 min，加入2 mL冷PBS，重复1 500 r/min离心5 min。然后进行细胞内染色，于室温避光条件下孵育2 h，将2 mL透膜缓冲液滴加至破膜剂重悬细胞中，离心洗涤后加入15 μL的PE-Cy5标记的Foxp3抗体，室温下避光30 min，加入2 mL PBS，1 500 r/min离心5 min，最后加入500 μL PBS重悬；(4)上机检测，设置相应对照管，采用BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)检测。

表1 3组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞情况比较

图1 流式细胞仪分选图

表2 外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平比较

采用实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)检测PBMCs Foxp3 mRNA表达情况，具体步骤如下：取上述实验制备的PBMCs，PBS洗涤1次后去除PBS，加入Trizol液1 mL，收集细胞并提取总RNA，利用分光光度计测量A260/A280，最终计算RNA样品的浓度及纯度。合成少量cDNA作为模板，进行PCR扩增。反应体系为20 μL，按照说明书进行RT-PCR反应。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，通过比较CT值计算mRNA相对表达水平。GAPDH和Foxp3的引物序列参考文献[4]。

另取各组孕妇晨起8：00空腹肘静脉血5 mL，经抗凝离心后获得血浆，按照游离雌三醇定量检测试剂盒(河南美凯生物科技有限公司，规格:48份/盒)采用顺磁性颗粒化学发光免疫测定法操作测定患者外周血中游离雌三醇的水平。

1.2.2观察指标 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对数、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比例、PBMCs Foxp3 mRNA表达水平及患者外周血中游离雌三醇的水平。

2 结果

2.13组外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞情况比较 轻度子痫前期组和重度子痫前期组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对数和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T均低于对照组(P<0.05)。同时，重度子痫前期组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对数和CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比例均低于轻度子痫前期组(P<0.05)，见表1、图1。

2.23组PBMCs Foxp3 mRNA情况 轻度子痫前期组与重度子痫前期组PBMCs Foxp3 mRNA水平较对照组明显降低，而重度子痫前期组低于轻度子痫前期组(P<0.05)。子痫前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平呈正相关(r=0.779,P<0.05)，见表2、图2。

图2 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例与PBMCs Foxp3 mRNA水平的线性相关图

2.33组血清雌三醇情况比较 轻度子痫前期组[(6.17±2.15)mg/L]和重度子痫前期组[(3.28±1.12)mg/L]血清雌三醇均低于对照组[(11.32±2.45)mg/L，F=15.279,P<0.05]；同时，轻度子痫前期组血清雌三醇高于重度子痫前期组(P<0.05)。子痫前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例与血清雌三醇水平呈正相关(r=0.584,P<0.05)，见图3。

图3 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例与血清雌三醇水平的线性相关图

3 讨论

子痫前期是妊娠期妇女特有且较为常见的一种疾病，又称先兆子痫，即在高血压的情况下出现抽搐症状[5]，我国发病率约在9%，孕产妇病死率占到妊娠相关死亡人数的10%～16%，是造成孕产妇死亡的第2大原因[6]。在疾病早期，患者可能无症状或出现轻度血压升高、轻度蛋白尿伴水肿，重度患者会出现头晕眼花、恶心呕吐、明显血压升高、蛋白尿增多等现象，甚至抽搐昏迷，危及生命[7-8]。目前临床上一般根据患者的临床症状、超声心动图、胎心监护、脑CT或磁共振(MRI)等检查及遗传病史来进行诊断治疗，通过合理使用硝苯地平等降压药进行降压治疗，用硫酸镁解痉，卧床休息甚至终止妊娠等方式来尽可能降低患者死亡率，保护母婴健康。在孕早期及时补充钙剂也是有效预防措施之一[9]。

子痫前期被认为是母体免疫系统对滋养层父系来源的抗原异常反应的结果，胚胎成功生长的关键是免疫耐受，而母体对胚胎无法产生足够的免疫耐受是子痫前期的发病机制之一[10-11]。由于CD4+CD25+Treg细胞有着抑制机体免疫活性的强大功能，所以它在免疫耐受中扮演着重要角色，也是内环境稳定的守护者，能够有效抑制机体对异体物质的排斥[12-13]。目前临床上已无轻度子痫前期的诊断，为了便于本次研究，仍将患者根据病情轻重分为轻度和重度，从结果来看，重度子痫前期组CD4+CD25+Treg细胞比例明显低于轻度子痫前期组和对照组(P<0.05)，轻度子痫前期组CD4+CD25+Treg细胞比例也显著低于对照组(P<0.05)，也就是说CD4+CD25+Treg细胞与子痫前期的发病机制具有相关性。

Foxp3是一种存在于细胞质的转录因子，对CD4+CD25+Treg细胞起到控制作用[14]，同时CD4+CD25+Treg细胞受Foxp3 mRNA和其转录蛋白质的特异性作用。正常情况下妊娠早期CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞显著增加，中期稍弱，分娩后显著减少，但孕妇处于子痫前期会导致该细胞水平降低，降低程度受病情严重影响[15]。如本研究结果中，轻度子痫前期组与重度子痫前期组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞绝对数、CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg比例均低于对照组(P<0.05)，同时，重度子痫前期组患者指标均低于轻度子痫前期组(P<0.05)。子痫前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例及PBMCs Foxp3 mRNA水平呈正相关。此外，雌激素水平在妊娠过程中发挥重要作用，可通过调节免疫耐受影响孕妇的妊娠结局[16]。在体外实验中，研究发现雌激素还可通过对性腺轴的调节增加Foxp3水平，同时使CD4+CD25+Treg细胞数量增多，但具体机制尚未阐明，有学者推测雌激素对免疫功能的调节作用可能通过调节Foxp3 等诸多转录因子的表达而完成[17]。雌三醇可抑制妊娠期T细胞的明显偏移，增强其活性，促进功能，作用也是举足轻重。而本研究也证明轻度子痫前期组和重度子痫前期组血清雌三醇显著低于对照组(P<0.05)，同时，轻度子痫前期组血清雌三醇也明显高于重度子痫前期组(P<0.05)，证实了子痫前期状态下CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数和雌三醇水平出现显著下降，在相关性分析中发现子痫前期患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例与血清雌三醇水平呈正相关，但二者间的作用机制有待进一步探究。

综上所述，子痫前期患者CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞明显减少，同时血清雌三醇也有所下降，这可能与子痫前期的发病机制及免疫耐受有关。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在子痫前期的发病机制中占据重要地位，后续研究应进一步探究子痫前期的发病机制，为临床防治提供理论依据。