Cthrc1抑制TGF-β1诱导成纤维细胞合成羟脯氨酸的机制研究*

刘 怡，李 娟

(四川省成都市第二人民医院皮肤科 610017)

成纤维细胞的活化、迁移、增殖，促使了Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成从而导致其在组织中的过度沉积是纤维化疾病的主要致病机制[1]。转化生长因子-β1(TGF-β1)是间质纤维化的关键细胞因子之一，可直接由成纤维细胞分泌，并作用于成纤维细胞，使其转化为肌成纤维细胞，促进其增殖并合成胶原，诱导纤维连接蛋白等的产生，提高成纤维细胞细胞外基质合成和沉积，增强细胞收缩的功能，同时抑制蛋白酶和基质酶的活性[2-3]。若能有效抑制TGF-β1对胶原蛋白的促进合成作用，则可对瘢痕等纤维化疾病有一定的治疗作用。胶原三螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1,Cthrc1)是一种表达在受损动脉外膜及内膜的分泌型蛋白[4]。Cthrc1基因的表达和动脉损伤的修复相关联，其表达和外膜的纤维化保持一致[5]。本研究发现在成纤维细胞中Cthrc1呈TGF-β1依赖性升高，Cthrc1特异性地抑制TGF-β1的促胶原蛋白合成作用。通过阐释Cthrc1与TGF-β1相互之间的关系对成纤维细胞胶原蛋白合成的影响，将对治疗纤维化相关疾病提供一定的治疗思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 人成纤维细胞株购自中国科学院昆明细胞库。CCK-8试剂盒购自欣博盛生物有限公司。羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Cthrc1正向引物：5′-CAA GGA AGC CCT GAA ATG A-3′，反向引物:5′-TCC ACT AAT CCA GCA CCA A-3′；β-actin正向引物：5′-AAG GCC AAC CGC GAG AA-3′，反向引物：5′-CCT CGT AGA TGG GCA CA-3′，均购自大连宝生物工程有限公司。重组人TGF-β1因子购自美国PeProTech公司。Cthrc1-siRNA单基因套装购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 成纤维细胞分别接种在RIMP 1640完全培养基(10%胎牛血清，100 mg/mL的链霉素、1×104U/L青霉素)常规培养(37 ℃、5% CO2)。按照实验设定分为空白对照(NC)组、TGF-β1组、TGF-β1+Cthrc1组、TGF-β1+si-Cthrc1组。

1.2.2质粒转染干扰成纤维细胞Cthrc1的表达 成纤维细胞铺板长至30%左右密度后，取0.67 μg(50 pmol)的PCMV6-XL4-Cthrc1或siRNA-Cthrc1，用无血清稀释液适量稀释，充分混匀，制成RNA稀释液。取1 μL的Entranster-R4000，加入24 μL无血清稀释液后制成Entranster-R4000稀释液，终体积为25 μL，室温静置5 min。将Entranster-R4000稀释液和RNA稀释液混匀，室温静置15 min。至此，转染复合物制备完成。将50 μL转染复合物滴加到有0.45 mL全培养基的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。转染后6 h观察细胞状态，若转染效果良好则用于后续实验。

1.2.3TGF-β1刺激成纤维细胞 成纤维细胞状态符合实验要求后，TGF-β1组加入浓度为103ng/mL TGF-β1因子溶液100～1 900 μL完全培养基，培养24 h。

1.2.4qRT-PCR检测各组Cthrc1 mRNA表达 各组加入TGF-β1培养24 h后，Triol法提取总RNA，紫外分光光度仪测定浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性。根据Takara RNA PCRTMKIT(AMV)Ver.3.0说明书反转录合成cDNA第1条链，应用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG 试剂盒进行qRT-PCR反应。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，然后95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s进行熔解曲线分析。每份样品设3个复孔，每组样品重复检测5次。应用2-△△ct方法计算目的基因相对表达水平。

1.2.5Western blot检测各组Cthrc1蛋白表达 各组加入TGF-β1培养24 h后，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白水平后，以50 μg为上样量进行凝胶电泳。按照目的蛋白分子量选取不同浓度的分离胶分离蛋白并电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，对应一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，相应二抗(1∶8 000稀释)孵育1 h。新配制电化学发光(ECL)超敏化学发光液进行显影，使用BIO-RAD凝胶成像仪进行成像并进行分析，用目的蛋白Cthrc1与内参蛋白β-actin的光密度比值，计算目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次，取平均值。

1.2.6CCK-8法检测各组细胞增殖能力的变化 按照实验分组建模后，收集各组细胞，在加入TGF-β1后 24、48、72、96 h依次加入CCK-8原液10 μL，37 ℃、5% CO2培养箱孵育2.5 h，酶标仪测定450 nm处吸光度(OD)值。实验重复5次，取平均值绘制细胞生长曲线。

1.2.7测定细胞上清液中Hyp表达水平 根据实验设计分别处理各组细胞后，收集各组TGF-β1刺激24 h后的细胞上清液，并按照Hyp测定试剂盒说明书进行操作。计算公式：Hyp表达水平(pg/mL)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空A管吸光度)×标准管浓度(5 pg/mL)×样品测试前稀释倍数。

2 结果

2.1TGF-β1促进成纤维细胞Hyp合成 TGF-β1组Cthrc1 mRNA水平高于NC组[(1.48±0.34)vs.(1.01±0.22)]，差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1组的细胞增殖能力于48 h后开始明显高于NC组，并于96 h达到峰值，差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1组Hyp水平明显高于NC组[(0.31±0.03)vs.(0.20±0.02)]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2Cthrc1抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞Hyp合成 与TGF-β1组比较，TGF-β1+Cthrc1组细胞增殖能力在96 h明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1+Cthrc1组Hyp水平明显低于TGF-β1组[(0.13±0.02)vs.(0.32±0.01)]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3Cthrc1的缺乏增强TGF-β1诱导的成纤维细胞Hyp合成 TGF-β1+si-Cthrc1组的细胞增殖能力在48、96 h明显高于TGF-β1组，差异有统计学意义(P<0.05)；TGF-β1+si-Cthrc1组的Hyp水平明显高于TGF-β1组[(0.43±0.03)vs.(0.31±0.01)]，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A：Cthrc1 mRNA表达情况;B:Cthrc1蛋白表达情况;C:细胞生长曲线;D:Hyp相对表达水平；a:P<0.05，与NC组比较

图1 TGF-β1促进成纤维细胞Hyp合成

A：Cthrc1 mRNA表达情况;B:Cthrc1蛋白表达情况;C:细胞生长曲线;D:Hyp相对表达水平；a:P<0.05，与TGF-β1组比较

图2 Cthrc1抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞Hyp合成

A：Cthrc1 mRNA表达情况;B:Cthrc1蛋白表达情况;C:细胞生长曲线;D:Hyp相对表达水平；a:P<0.05，与TGF-β1组比较

图3 Cthrc1的缺乏增强TGF-β1诱导的成纤维细胞Hyp合成

3 讨论

纤维化是各种原因引起的炎症导致的组织器官实质细胞的坏死，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)异常增多，并在组织中过度沉积[6]。目前认为成纤维细胞合成胶原蛋白增多是许多纤维化疾病的主要特点[7]。在其发病机制中促纤维化和抗纤维化因子在调节胶原蛋白合成上起着关键的作用[8]。Hyp是一种非必需氨基酸，在胶原蛋白中表达水平高且恒定，其水平能客观反映纤维发生的程度和演变过程[9]。本研究通过调节Cthrc1的表达，发现Cthrc1可以影响TGF-β1诱导下成纤维细胞Hyp的合成，在纤维化疾病中有一定的调节作用。

TGF-β1是目前发现的能促进成纤维细胞增殖并促进其合成胶原，同时抑制蛋白酶和基质酶的活性，也是促进ECM沉积的主要调控因子[10]。本研究发现TGF-β1在促进成纤维细胞合成Hyp的同时，也增加了Cthrc1蛋白的表达。Cthrc1是TGF-β1特异性的抑制剂，可以抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活，在免疫相关性肝病和特发性肺纤维化等疾病中有着重要作用[11-12]。本研究通过改变成纤维细胞Cthrc1的表达水平，发现补充Cthrc1可以抑制TGF-β1诱导的Hyp合成，而干扰Cthrc1则能增强TGF-β1对Hyp合成的促进作用。在博来霉素诱导的肺纤维化研究中也发现，Cthrc1可以通过抑制Hyp的合成来保护肺功能[13]。但并非过度分泌的Cthrc1则有利于纤维化疾病的治疗，有研究报道Cthrc1也可激活肝星状细胞，促进肝纤维化的发生与发展[14]。

综上所述，笔者认为TGF-β1与Cthrc1之间存在相互调节作用，TGF-β1的表达可以诱导Cthrc1的表达，而Cthrc1则反馈性抑制TGF-β1的过度激活，该平衡机制在纤维化疾病中有着重要调控作用。在后续的研究中，笔者将进一步探讨Cthrc1抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的合理表达丰度值，若能有效调节Cthrc1的表达，则可为临床纤维化相关性疾病的治疗提供一些理论依据。