甲醇沙蚕提取物对沙门氏菌抑菌活性研究

刘海鹏（衡水学院生命科学系 河北 衡水 053000）

沙门氏菌被认为是引起鱼、龟等水产养殖品种腐皮病的致病菌之一，对水产养殖业危害巨大。随着抗菌药物在医学和兽医临床上的广泛应用，沙门氏菌的耐药性越来越高。沙蚕是一类生活在海边潮间带的海洋生物，体内含有多种生物活性成分，是可利用的重要的药物资源，因此研究和开发沙蚕体内抗菌活性成分对解决耐药菌株有重要意义。本试验采用甲醇对沙蚕体内活性物质进行提取，通过提取物对沙门氏菌进行体外抑菌实验，为沙蚕体内生物活性物质的开发提供理论和实验依据。

1 材料

1.1 样品与菌株。沙蚕，采购于山东舟山某水产养殖场。沙门氏菌，衡水学院微生物实验室提供。

1.2 主要仪器。电热鼓风干燥箱、XDSY-2000A旋转蒸发仪、SW-CT-IF超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、超声波震荡仪。

2 方法

2.1 沙蚕提取物的制备。将清水洗净的沙蚕烘干、粉碎后研磨成粉末状，将甲醇和沙蚕混匀，超声波震荡仪中震荡30 min，重复3次，所得滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，最后所得溶液用甲醇稀释至浓度为100 mg/ml，高压灭菌后，放于4℃冰箱保存，备用。

2.2 菌悬液的制备。无菌条件下，将活化的沙门氏菌接种至LB培养基进行恒温培养并计算菌悬液浓度。取1 ml已制备好的菌悬液加9 ml无菌水进行10倍倍比稀释，取1×10-5～1×10-95种稀释度涂板，每个浓度做3个平行，做好标记，将涂好后的培养基倒置于37℃恒温箱中培养1～2 d。选择每个平板上长有50～300个菌落的稀释度进行菌落计数。计算公式：1 ml样品中菌落形成单位数(CFU)=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数，最后配置成浓度为1×106cfu/ml的菌液备用。

2.3 沙蚕提取物最小抑菌浓度(MIC)的测定。采用试管二倍稀释法测定每种沙蚕活性提取物的最低抑菌浓度(MIC)。取已处理好的无菌试管，通过试管二倍稀释法，制备试管提取物浓度为12.5 mg/ml、3.13 mg/ml、0.78 mg/ml、0.195 mg/ml、0.098 mg/ml、0.049 mg/ml，同时做空白对照和溶剂对照，空白对照不含提取物药液，溶剂对照不含提取物却含有等剂量相应溶剂。

2.4 体外抑菌圈直径测定。利用牛津杯法测定沙蚕提取物体外抑菌圈直径。用移液枪吸取100 μl沙蚕提取物注入牛津杯内，将平板培养基在37℃恒温培养箱中培养24 h后观察并测量抑制圈的直径大小。每种提取物做3个重复，取平均值。结果判定，抑菌圈直径小于10 mm为轻度抑菌，抑菌圈直径10～15 mm为中度抑菌，抑菌圈直径15～20 mm为高度抑菌，抑菌直径大于20 mm为极度抑菌。

3 结果与讨论

3.1 体外抑菌圈的测定。结果见表1。由表1可知甲醇沙蚕提取物对沙门氏菌有中度抑菌效果。其抑菌圈直径平均值为9.28 mm，空白对照组与甲醇抑菌圈直径为0 mm，无抑菌效果。

表1 不同沙蚕提取物体外抑菌圈直径(mm)

3.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定。结果见表2。由表2可知，甲醇沙蚕提取物对沙门氏菌的MIC值为0.098 mg/ml。

表2 甲醇沙蚕提取物对沙门氏菌MIC的测定(mg/ml)

3.3 讨论。本试验通过使用甲醇对沙蚕体内活性物质提取并进行抗菌试验，发现其提取物对沙门氏菌具备一定的抗菌性，而甲醇本身对沙门氏菌无抑菌性，表明沙蚕体内的生物活性物质对沙门氏菌有抗菌效果，本研究为沙门氏菌相应抗菌药的开发打下了一定的基础。值得注意的是，在甲醇粗提物中哪一种成分起到主要作用尚不可知，需要深入研究。而当前对沙蚕体内活性物质的研究主要集中在沙蚕毒素的抗癌、抗氧化作用上，本研究结果为进一步开发沙蚕体内活性物质提供了一个新的方向。