蜂王浆调节小鼠免疫功能研究

周明良，喻建辉，余春涛，江平屿

（江西汪氏蜜蜂园有限公司，江西南昌 330100）

0 引言

蜂王浆是蜜蜂巢中培育幼虫的5～15日青年工蜂咽头腺的分泌物[1]，也就是成年蜜蜂采食花粉后，自身分泌出的一种不同于蜂蜜的乳状物质，天然的蜂王浆颜色为乳白色，由于其中成分的高低或者环境差异，有时也会呈现微黄色，此乳状物就像哺乳动物的乳汁，是供给将要变成蜂王的幼虫的食物，营养成分较为复杂，并且极具营养价值和免疫功能，也是蜂王一直都要食用的食物，在保健功能食品上有着极为重要的应用价值，也可以应用于医疗中，是介于食品与药品之间的纯天然保健食品[2]。

蜂王浆成分比较复杂，其中含有维生素A族以及B族物质，另外蛋白质和糖类是其中含量较多的物质，脂类物质液存在蜂王浆中，除去这些大分子物质，还有一些人体需要的氨基酸，在蜂王浆中也有发现。据研究，蜂王浆中含有26种以上的游离氨基酸[3]。10-羟基-α-癸烯酸，是人们较为熟知的王浆酸，生物术语上一般简写成10-HDA。王浆酸是自然界中很稀有的物质，一般来说是蜂王浆中特有的物质，常常代表着蜂王浆品质的优劣。蜂王浆食用营养价值极高，在蜂王浆的总脂肪酸中占有的比例在50%以上，同时还具有抗菌、抗病、抑制癌细胞生长等作用[4]。

许多国内外营养学家对蜂王浆进行了大量的研究认为，蜂王浆是一种可供人类直接食用的、具有高活性成分的超级营养食品。其中，周爱萍等人[5]通过动物试验研究发现，分别经口给予小鼠不同剂量的蜂王浆30 d，能明显增加抗体生成细胞数，高剂量试验中还能提高小鼠NK细胞活性率，表明蜂王浆具有调节小鼠免疫的功能。张敬等人[6]观察蜂王浆冻干粉对小鼠免疫功能影响时发现，蜂王浆冻干粉可以提高小鼠单核巨噬细胞系统和细胞免疫。同时还有研究表明，蜂王浆除了能满足蜂王和幼虫的基本新陈代谢以外，还可以调节身体机能和免疫功能[7-8]。

试验通过采用不同剂量的蜂王浆灌胃小鼠，通过观察其体重的变化，脏器/体重的比值、NK细胞活性率、淋巴细胞转化率、半数溶血值及抗体生成细胞数来研究蜂王浆对小鼠免疫功能的影响。

1 材料和方法

1.1 样品

由江西汪氏蜜蜂园有限公司提供的蜂王浆软胶囊，其中内容物中蜂王浆冻干粉的比例为34%，于4℃下保存，供试验用。

1.2 试验动物及环境

SPF级昆明种雌性小鼠200只，体重18～22 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，饲料也由该单位提供，试验共分为两大组，每大组有小鼠40只，免疫一组进行NK细胞的活性测定、进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验；免疫二组，进行脏体比值测定、半数溶血值（HC50）的测定和抗体生成细胞数的测定。试验期间，控制环境温度为22～24℃，湿度为50%～56%。

1.3 剂量设计

人体推荐摄入量为3.0 g/日剂量的设计需参考人体，以其每日推荐量来确定，其每日推荐摄入量为3.0 g/日，相对剂量设计来说，也就是0.05 g/（kg·bw），根据该推荐量设置3个剂量组，5倍的低剂量组0.25 g/（kg·bw）、10倍的中剂量组0.5 g/（kg·bw）、30倍的高剂量组 1.5 g/（kg·bw），分别取汪氏牌蜂王浆软胶囊内容物5.0，10.0，30.0 g加植物油定容至200 mL，按0.1 mL/10 g·bw体积给小鼠灌胃，对照组给予相同体积的植物油。每天1次，连续灌胃至少30 d。

1.4 仪器与试剂

动物台秤、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722型分光光度计、恒温水浴箱、酶标仪、显微镜等。

无菌手术器械、游标卡尺、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板，96孔U型细胞培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素吸管、载玻片等。

SRBC、生理盐水、Hank's液、RPMI1640培养液、小牛血清、青链霉素、ConA、1%冰醋酸、1 mol/L的HCl溶液、酸性异丙醇、MTT、PBS缓冲液（pH值7.2～7.4）、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试纸、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液、2.5%Triton、印度墨汁、0.1%的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。

1.5 试验方法

1.5.1 脏器/体重比值测定

称量后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，在电子分析天平上称量，计算脏器/体重比值。

1.5.2 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验（MTT法）

取脾，在无菌环境下，将小鼠的脾脏取出，小平皿中装有适量无菌Hank's液，然后把小鼠的脾脏放入，制成细胞悬液，细胞悬液需要经过筛网过滤，过滤目数在200目即可，离心前需要用Hank's液清洗，清洗次数2～3次。过滤后的细胞悬液还需要经过离心，每次离心10 min（转速1 000 r/min）。细胞悬液是用来活细胞计数，所以需要将处理好的细胞悬液放在1 mL完全培养液中，细胞浓度不宜过高或过低，一般设置在3×106个/mL，此时需要用RPMI1640培养液来对其进行调整，细胞悬液经过调整后要分成2孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，在其中一孔加75μL ConA液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，设置培养时间为72 h，培养环境中需要5%二氧化碳，控制温度为37℃。培养时，需要注意不能直接等时间结束后取出，在结束前4 h要吸取上清液0.7 mL，用不含小牛血清的RPMI1640培养液0.7 mL进行补充，与此同时还应该加入MTT（5 mg/mL），也就是相当于50μL/孔的量继续培养，时间为4 h。酸性异丙醇要在培养结束后的时候加入，每孔加入1 mL，轻轻吹气搅打混匀，使得紫色结晶的物质完全溶解。溶解后才能分装在培养板中，每个培养板为96孔，每个孔都需要作平行，数目为3个，测定光密度值使用酶标仪，设置570 nm波长。淋巴细胞的增殖能力就可以用光密度值来表示，即用ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值。

1.5.3 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）

取羊血，使用生理盐水洗涤，洗涤次数2～3次，之后需要以转速2 000 r/min离心10 min，SRBC需要用生理盐水配成质量分数为20%的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2 mL。4 d后，将小鼠处死、取脾，在无菌环境下将小鼠的脾脏取出，小平皿中装有适量无菌Hank's液，然后把小鼠的脾脏放入，制成细胞悬液，细胞悬液需要经过筛网过滤，过滤目数在200即可，离心前需要用Hank's液清洗，清洗次数2～3次。细胞悬液是用来活细胞计数用，所以需要将处理好的细胞悬液放在8 mL完全培养液中，细胞浓度不宜过高或过低，一般设置在5×106个/mL。表层培养基需要稍微加热使其完全溶解，溶解后、要用2倍浓度的Hank's液与表层培养基等量混合，Hank's液酸碱度应调节为pH值7.4，混合后分装小试管，每管0.5 mL，再向管内加入用SA液配制的10%SRBC 20μL（V/V）、20μL脾细胞悬液 （5×106个/mL），准备好刷有薄层琼脂糖的玻片，快速将悬液混合，混合后倒在玻片上，玻片扣在玻片架上应保持水平，待琼脂糖凝固，放入二氧化碳培养箱中温育，温育时间为1.5 h，然后用SA液稀释的补体，补体比例为（1∶8） 加入到玻片凹槽内，继续温育1.5 h后，计数溶血空斑数来表示抗体生成水平。

1.5.4半数溶血值（HC50）的测定

取羊血，然后使用生理盐水洗涤，洗涤次数2～3次，SRBC需要用生理盐水配成质量分数为2%的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2 mL。4 d后，取血样品放在离心管，方式也略有不同，用摘除眼球的方法，样品血不能立即处理，需要放置1h，血样品会凝固，然后从管壁上取下，血清要分离，以转速2 000 r/min离心10 min，这样血清会分离得比较充分，收集血清。血清需要稀释一定的倍数，以200倍为佳，稀释液用SA，取1 mL置试管内，用SA缓冲液配制10%（V/V） SRBC和补体（1∶8） 分别加入0.5 mL和1 mL。这里的对照管加SA缓冲液。置恒温水浴中保温，温度37℃，时间30 min，保温后要使用冰浴停止反应。以转速2 000 r/min离心10 min，取上清胞100μL搅拌，之后再加入2.5%Triton 100μL，这些孔都需要设置平行孔，一般要设置3个，处理好后放在二氧化碳培养箱中培养4 h，二氧化碳体积分数为5%，培养温度37℃，然后将96孔培养板放在离心机中离心5 min处理，转速设置为1 500 r/min，然后吸取每个孔的上清液100μL，同样也要放在平底96孔的培养板中培养一段时间。除了这个处理，LDH基质液也要及时加入等量的覆盖混匀，由于室温的不同，一般反应3～10 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30μL，在酶标仪处测定光密度（OD），测定波长设置为490 nm。

1.6 试验数据统计

1 mL，加都氏试剂3 mL。SRBC用SA缓冲液配制的10%（V/V），使用0.25 mL，空白对照用等量的都氏试剂，分别于波长540 nm处测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下式计算：

数据需要经过转化和统计分析，试验中采用Excel，Spss软件进行。用Spss软件分析时，如果方差齐，波动较小，那么单因素方差分析之后，再进行总体比较，发现差异的时候要用Dunnett法对剂量组进行比较。如果方差不齐，对原始数据有适当的转化是正常的，这样使得数据满足方差齐性，用转换后的数据进行统计；如果达不到方差齐，则改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，采用Tamhane'sT2检验进行两两比较，该方法不要求方差齐性。

1.5.5 NK细胞活性的测定（乳酸脱氢酶测定法）

受试小鼠采用颈椎脱臼的方法处死，将小鼠的脾脏作为观察对象，取脾时要在无菌环境下，将取出的脾脏小心碾碎，制成一定浓度的细胞悬液，并采用Hank's液洗2～3次。经过洗涤后，对悬液进行离心10 min（转速1 000 r/min） 处理，丢弃浮起的上清液，将细胞浆弹起。用灭菌水0.5 mL处理20 s即可，经此方法处理可以裂解红细胞，然后再加入0.5 mL Hank's液及8 mL Hank's液，同样要采用离心的处理，以转速1 000 r/min离心10 min即可。将样品进行重悬处理，小牛血清的RPMI1640完全培养液的质量分数10%，1 mL处理即可，计数前要处理，用1%冰醋酸稀释，计数活细胞采用苔酚蓝染色的方法，（活细胞数达95%以上的样品才可以采用），细胞浓度不宜过高或过低，这里调整为2×107个/mL，得到效应细胞，生长良好的YAC-1细胞才可以用作有效的试验，需经过传代24 h，细胞浓度需要使用RPMI1640完全培养液，调整为4×105个/mL，得到靶细胞；靶细胞和效应细胞都取100μL（由于浓度的不同，所以对应的效靶比为50∶1），取好后混匀加入U型培养板中，培养板使用96孔；靶细胞自然释放，先加靶细胞100μL搅拌，之后再加入培养液100μL混合均匀，靶细胞最大释放孔先加靶细

2 结果与分析

2.1 样品对正常小鼠体重的影响：

表1 免疫一组小鼠体重（±s，g）

表1 免疫一组小鼠体重（±s，g）

组别 动物数/只 初始体重 中期体重 末期体重 增重对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 10 10 12.68±1.66 13.19±2.06 13.51±1.55 12.44±2.12 19.85±1.25 19.82±1.20 19.81±1.12 19.92±1.24 28.19±1.93 28.00±1.18 28.36±1.99 27.61±2.18 32.53±1.89 33.01±2.27 33.32±2.36 32.36±3.01

表2 免疫二组小鼠体重（±s，g）

表2 免疫二组小鼠体重（±s，g）

组别 动物数/只 初始体重 中期体重 末期体重 增重对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 10 10 19.64±1.21 19.68±1.18 19.62±1.03 19.71±1.16 27.60±1.98 27.82±1.79 27.57±1.91 28.30±1.89 32.30±2.87 33.05±2.37 32.43±3.56 33.17±2.78 12.66±2.13 13.37±1.74 12.81±2.68 13.46±1.99

由表1，表2可见，各剂量组在体重方面，从试验初期、中期、末期来看与对照组比较，差异性均无显著性 （p＞0.05）。

2.2 样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响

表3 样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值影响（±s，g）

表3 样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值影响（±s，g）

组别 动物数/只脾脏/体重/% p值 胸腺/体重/% p值对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 10 10 0.465±0.079 0.491±0.136 0.528±0.101 0.551±0.121 0.335 0.319±0.064 0.340±0.095 0.361±0.076 0.371±0.074 0.467

由表3可见，样品各剂量对小鼠脾脏/体重比值和胸腺/体重比值无显著影响（p＞0.05）。

2.3 样品对小鼠细胞免疫功能的影响

表4 样品对小鼠ConA诱导的淋巴细胞转化能力的影响（±s）

表4 样品对小鼠ConA诱导的淋巴细胞转化能力的影响（±s）

组别 动物数/只加ConA的OD值不加ConA的OD值淋巴细胞增殖能力（OD差值） p值对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 10 10 0.223±0.020 0.231±0.014 0.218±0.025 0.220±0.014 0.189±0.025 0.190±0.016 0.169±0.037 0.155±0.027 0.035±0.022 0.041±0.023 0.050±0.023 0.065±0.024-0.869 0.333 0.015

由表4可见，样品高剂量组小鼠淋巴细胞转化能力明显高于对照组（p＜0.05）。

2.4 样品对体液免疫的影响

2.4.1 样品对小鼠抗体生成细胞数的影响

表5 样品对小鼠抗体生成细胞数的影响（±s）

表5 样品对小鼠抗体生成细胞数的影响（±s）

组别 动物数/只 溶血空斑数（个/106个脾细胞） p值对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 10 10 120±59 153±72 170±64 206±54-0.511 0.198 0.011

由表5可见，高剂量组小鼠抗体生成细胞数与对照组比较显著提高（p＜0.05）

2.4.2样品对小鼠半数溶血数值（HC50）的影响

样品对小鼠半数溶血数值（HC50）的影响（±s） 见表 6。

表6样品对小鼠半数溶血数值（HC50）的影响（±s）

表6样品对小鼠半数溶血数值（HC50）的影响（±s）

组别 动物数/只 半数溶血值 p值对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 10 10 144.33±25.77 161.08±20.80 171.18±33.59 181.75±34.16-0.440 0.115 0.018

由表6可见，高剂量组小鼠半数溶血数值（HC50）与对照组比较显著提高（p＜0.05）。

2.5 样品对小鼠NK细胞活性的影响

表7 样品对小鼠NK细胞活性的影响（±s）

表7 样品对小鼠NK细胞活性的影响（±s）

组别 动物数/只NK细胞活性/%NK细胞活性平方根反正弦转化值 p值对照组低剂量组中剂量组高剂量组10 10 10 10 22.42±11.43 30.29±12.38 37.35±10.40 39.19±9.59 27.40±8.64 32.87±8.30 37.54±6.14 38.66±5.62-0.869 0.333 0.015

由表7可见，中、高剂量组小鼠NK细胞活性与对照组比较显著提高（p＜0.05或p＜0.01）。

3 结论

在试验条件下，经口灌胃给予小鼠0.25，0.50，1.50 g/（kg·bw） 剂量的汪氏牌蜂王浆软胶囊30 d，与对照组比较0.50，1.50 g/（kg·bw） 剂量能显著提高小鼠NK细胞活性，1.50 g/（kg·bw） 剂量能显著提高小鼠半血溶血值、抗体生成细胞数、淋巴细胞转化能力（p＜0.05），各剂量对小鼠体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值均无明显影响（p＞0.05）。表明蜂王浆具有增强小鼠免疫力的功能。

综上所述，蜂王浆在对小鼠免疫功能的影响有一定的调节作用，正常小鼠在灌食一定剂量的蜂王浆后，其体重并未发生明显变化，脏器/体重比值也未观察到明显变化。中、高剂量的蜂王浆能明显提高小鼠NK细胞活性，高剂量蜂王浆能明显提高小鼠半血溶血值、抗体生成细胞数、淋巴细胞转化能力。蜂王浆所含营养物质较多，营养成分特别复杂，就目前已有的研究来说，蛋白质是蜂王浆干物质的主要成分，蜂王浆中的蛋白质有12种以上，此外还有许多小肽类物质。蜂王浆中含有很多酶类蛋白质，如胆碱酯酶、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽酶和碱性磷酸酶等[9]。另外，蜂王浆中还含有许多脂类有机酸，蜂王浆的特征性成分是短链羟基脂肪酸，已检测到的有：10-羟基2-癸烯酸（10-HDA）、癸酸、2-十二碳烯二酸、10-羟基癸酸、3-羟基癸酸、9-十四烯酸、9-十六烯酸、琥珀酸、十三烷酸、棕榈酸、亚油酸、花生酸、月桂酸、亚麻酸等多种游离脂肪酸[10-11]，其中10-HDA是蜂王浆中十分重要的物质，是特有的不饱和脂肪酸[12]，因其在不同温度、不同保存时间的蜂王浆中含量稳定[13-15]，因此成为评价蜂王浆品质的重要指标。由于蜂王浆中营养成分物质太多，具体是哪些组分对免疫功能进行调节仍需要进一步研究。