梅毒螺旋体对新西兰兔睾丸的病理损伤及其对精子产生的影响

胡志祥 邹丹阳 廖春洁 郑 昕 倪礼楠 尚梦雅 闫静敏 周平玉,*

1.安徽医科大学上海皮肤病临床学院（上海 200050）；2.上海市皮肤病医院

梅毒（Syphilis）是由梅毒螺旋体(TreponemaPallidum,TP)感染引起的在全球范围内广泛流行的慢性、系统性性传播疾病[1]。在中国，梅毒已经超越淋病成为最常见的性传播疾病，稳居我国传染病的前三位，数据显示2017年我国有超过47万人新感染梅毒[2]。

已知梅毒螺旋体可侵犯人体各器官组织引起不同的病理损伤并出现相应的临床表现，而迄今梅毒螺旋体对人体睾丸的病理损伤及精子影响的研究鲜少有报道。基于新西兰兔的梅毒模型与人类的梅毒感染有很多相似之处[3]，本研究将梅毒螺旋体接种新西兰兔睾丸，研究梅毒螺旋体感染后不同时间点睾丸的形态学改变、病理损伤及其对精子的影响，以期初步认识梅毒螺旋体对男性生殖系统的影响。

材料和方法

一、实验动物

纯种新西兰雄兔购于上海奉贤辉煌养殖场[SCXK（沪）2009-0022]，体质量 2.8～3.5 kg，兔龄在 3个月左右，饲养于不锈钢干养式兔笼中，饲料（上海仕林生物科技有限公司）及饮水均不含抗生素。

二、菌株

Nichols标准株由美国华盛顿大学梅毒研究团队馈赠、厦门大学附属中山医院检验科转赠。

三、主要试剂

10%福尔马林溶液由1份40%甲醛（西陇化工股份有限公司，广东汕头）与9份双蒸水配制而成，梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）和甲苯胺红不加热反应素试验（TRUST）试剂均由上海市荣盛生物药业有限公司提供。苏木素伊红试剂盒与Warthin-Starry试剂盒分别由上海杰浩生物有限公司和美国abcam公司提供。

四、实验方法

（一）菌株的接种

将12只新西兰兔称量后随机分为8只活性菌株接种组和4只灭活菌株接种对照组。接种前采集所有家兔的外周血进行检测以排除梅毒螺旋体的感染。活性菌株接种组：从-80℃冰箱中取出加有50%甘油的冻存菌株，置于37℃水浴锅中快速融化解冻菌株。将新西兰兔麻醉后，用医用安尔碘消毒阴囊区域进行双侧睾丸接种，每侧睾丸注射暗视野显微镜下TP计数为3×107个/mL的Nichols株各1mL。灭活菌株接种对照组：所用接种菌株均经过56℃水浴锅水浴1h，其余条件均和活性菌株接种组相同。将所有接种后的新西兰兔随机分为3d组、7d组、14d组和21d组，保证每个时间点的分组内包括2只活性菌株接种的新西兰兔和1只灭活菌株接种的新西兰兔。

（二）睾丸形态学观察

接种前和接种后每隔3d观察、触诊并记录所有新西兰兔睾丸形态学变化情况，包括大小、硬度、水肿程度、回缩状况和溃疡发生情况。

（三）睾丸组织学观察

在接种后的第3天、第7天、第14天和第21天用空气栓塞法处死对应时间段分组的新西兰兔并剥离睾丸组织，用组织剪剪去每侧睾丸的中末端，于10%福尔马林溶液充分固定后，送至上海市皮肤病医院病理科经取材、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋和切片后分别进行HE染色和Warthin-Starry镀银染色（W-S）。HE染色：石蜡切片经常规烘烤脱蜡水化后进行苏木素染色、蓝化伊红复染、脱水、透明、树脂封片。W-S镀银染色：石蜡切片进行常规脱蜡水化，于螺旋预备液常温处理5分钟后浸泡于已预热的0.5%硝酸银溶液3～5min，将切片置于还原液中浸染1～5min（此过程于65～70℃震荡水浴锅内进行），之后进行热纯水冲洗、脱水、透明、树脂封片。阅片由专业病理人员在光学显微镜下进行。

（四）兔外周血样本的采集

于处死家兔的4个时间点用真空抗凝管经兔耳缘静脉采血2mL，经3000×g离心5min后取上层血清行梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）和甲苯胺红不加热反应素试验（TRUST）检测。

结 果

一、不同时间点兔睾丸的形态学变化

活性菌株接种组睾丸形态学表现如图1所示，与接种前相比，接种后第9天兔睾丸开始逐渐肿胀且触诊变硬，于12～15d时兔睾丸肿胀最为明显且均不可回缩，部分兔睾丸伴明显水肿。随后兔睾丸肿胀程度逐渐减小，且触诊硬度逐渐下降，至第21天兔睾丸恢复至比接种前稍大且略硬状态。本次实验中所有新西兰兔均未发生睾丸溃疡。灭活菌株接种组仅在接种后第3天出现轻微睾丸肿胀，无明显变硬。

图1 活性菌株接种组不同时间点兔睾丸形态学表现

二、兔血清TPPA和TRUST结果

活性菌株接种组接种前及接种后的3d组兔血清样本TPPA及TRUST检测结果均为阴性，7d组、14d组和21d组家兔血清的TPPA结果呈阳性，TRUST滴度呈上升趋势，其中除外14d组中1号兔血清TPPA和TRUST结果均为阴性，表明其梅毒模型建立失败，将其剔除实验组。灭活菌株接种组各时间点采集的兔血清样本检测结果均为阴性。详见表1。

表1 兔血清TPPA和TRUST结果

三、接种后不同时间点的兔睾丸病理表现

根据已有研究显示：正常兔睾丸由紧密间隔的生精小管和间质区组成。生精小管由排列整齐的精原细胞组成，完全成熟的精子通常见于腔内。管间间隙或间质区包含小静脉、小动脉和间质细胞，也可见少量分散的淋巴细胞[4,5]。在活性菌株接种组中：3d组的兔睾丸组织学特征为出现急性炎症的显微区，主要表现为少量的多形核白细胞（中性粒细胞为主）和淋巴细胞浸润，尤其在血管周围 （图2 A）；7d组的兔睾丸组织切片中间质和血管区出现中度炎症改变，多形核细胞较3d组减少，淋巴细胞的比例明显增加（图2 B）；14d组的兔睾丸间质和血管区出现明显的单核细胞和淋巴细胞浸润，生精小管出现萎缩，精子产生受到抑制（图2 C）；21d组的兔睾丸组织切片中出现近乎满视野的淋巴细胞浸润，睾丸间质出现纤维化，生精小管萎缩明显，成熟精子数量显著减少（图2 D）。

作为对照组，灭活菌株接种组的兔睾丸病理切片组织学特征除了在3d组中出现了急性炎症，表现为少量的多形核白细胞和淋巴细胞浸润外，其余时间点和正常睾丸组织病理表现无明显差异（图3）。

图2 活性菌株接种组接种后不同时间点的兔睾丸病理表现

图3 灭活菌株接种组接种后不同时间点的兔睾丸病理表现

四、接种后不同时间点的兔睾丸镀银染色表现

如图4所示，活性菌株接种组中3d组兔睾丸镀银染色显示梅毒螺旋体位于生精小管中，7d组及14d组结果显示梅毒螺旋体位于间质区，而在21d组的兔睾丸镀银染色中未发现梅毒螺旋体。灭活菌株接种组的兔睾丸镀银染色中未发现梅毒螺旋体存在。

图4 活性菌株接种组接种后不同时间点兔睾丸镀银染色表现

讨 论

梅毒是一种全身性疾病，梅毒的病原体梅毒螺旋体可侵犯人体各个器官组织，如皮肤黏膜、眼、神经系统、内脏器官等。根据文献，梅毒睾丸炎、梅毒性睾丸鞘膜积液等病例也被陆续报道出来[6,7]，近期一项研究显示，1名梅毒病人的精液中检测出了梅毒螺旋体[8],因而梅毒螺旋体对睾丸的影响引发关注，它是否会通过影响男性生殖系统和精子而导致男性的生育问题，应该引起我们足够的重视。迄今为止，梅毒螺旋体在体外的长期培养依旧是梅毒研究的难点，但其在实验动物体内的传代培养技术已经相当成熟。大量研究表明新西兰兔是梅毒研究很好的动物模型，经睾丸接种可对梅毒螺旋体进行传代扩增，而经背部皮损接种可以很好的模拟一期梅毒典型的硬下疳皮损[9]。由于新西兰兔的梅毒模型可模仿人类的梅毒感染的许多临床症状，故此我们选用新西兰兔建立梅毒模型来研究梅毒螺旋体对睾丸的病理损伤及其对精子产生的影响。

Lukehart等的研究显示新西兰兔经睾丸接种梅毒螺旋体后，在9～11d里睾丸出现明显临床症状[10]，这与我们的实验结果12～15d有所差别。因此不能依据固定的时间点作为处死家兔分离梅毒螺旋体菌株的指标，必须根据实际的睾丸肿胀程度来判定。本实验还通过对兔血清进行TPPA及TRUST检测来判定梅毒兔模型是否建立成功，根据文献及经验，活性菌株接种兔睾丸所建立的梅毒兔模型其梅毒血清试验约在1周内可转阳[11,12]，本实验中活性菌株接种组中3d组中兔梅毒血清试验结果暂未转阳，其余3组其兔血清TPPA及TRUST结果均为阳性，故其梅毒兔模型建立成功。其中除外14d组中1号兔梅毒模型建立失败，故由此将其剔除实验组。

早在1980年就有文献报道，经睾丸接种梅毒兔模型在感染初期其睾丸组织学特征是单核细胞浸润，在感染后的第6天即有淋巴细胞浸润，第13天达到高峰，随后逐渐出现巨噬细胞，病灶中浸润的淋巴细胞以T细胞为主[13]，这与我们的实验结果显示的早期睾丸病理表现中以多形核白细胞和淋巴细胞浸润为主有所区别。但在另一项研究中[14]，分别选取接种后的第3天、第6天、第11天和第24天的兔睾丸病理结果中其炎症细胞浸润特点与我们的实验结果无明显差异。这说明在梅毒感染的早期，即使机体对梅毒螺旋体做出快速的免疫应答，但随着梅毒螺旋体的不断增殖，机体的炎症反应会不断加重，进而致使睾丸中生精管不断萎缩和间质纤维化，成熟的精子明显减少。为了了解梅毒螺旋体在兔睾丸组织内的分布情况，我们对其进行了镀银染色。我们于活性菌株接种3d组的兔睾丸生精小管中发现了梅毒螺旋体的存在，而后在7d及14d组的兔睾丸间质区内发现了梅毒螺旋体，然而21d组兔睾丸中则未有梅毒螺旋体，这也与前面的结果相对应，在淋巴细胞和单核细胞浸润的高峰期后，兔睾丸内的梅毒螺旋体被清除，根据研究显示淋巴细胞在迁移到感染部位后释放淋巴因子吸引并激活巨噬细胞，被激活的巨噬细胞可吞噬并杀死梅毒螺旋体[13]。与我们的结果不同的是，Lukehart等[13]和Lauderdale等[15]仅在兔睾丸间质区中发现了梅毒螺旋体，而生精小管中未见其分布。但在梅毒病人的精液中也存在梅毒螺旋体这一事实这也表明我们的结果是合理的。梅毒螺旋体可侵入兔睾丸间质区和生精小管中，而它可通过黏多糖酶、透明质酸酶等机制对机体组织造成损伤[16]，故我们推测梅毒螺旋体所造成的睾丸损伤不仅是因为其诱发宿主免疫反应的产生，也有可能与它本身入侵所造成的组织损伤有关。

本实验所建立的梅毒兔模型在其病程发展中出现了睾丸损伤以及精子数量减少的表现，我们可以推测梅毒螺旋体可能会通过造成睾丸组织损伤及精子数量减少等影响其生育情况，但由于无法从梅毒患者中完成相关探究，且我们仅选取了接种后3周内的兔睾丸进行实验，且实验兔数量存在一定限制，所以针对男性梅毒患者在感染梅毒螺旋体后是否会在一定的时间段内因成熟的精子数量减少而影响到生育能力，需要我们更进一步的研究。