LPS注射对家蚕幼虫MyD88基因的影响

李佳璇 王涛 李树强 司徒金容 刘吉升

摘  要：为探究LPS（脂多糖）等外源物质对家蚕MyD88基因表达的影响，本实验将无菌水、LPS和大肠杆菌注射到5龄家蚕幼虫体腔内，在0、3、6和24 h进行解剖取样，通过凝胶电冰分析不同时间MyD88基因在各组织中的表达水平。电泳条带显示，在脂肪体组织中，注射LPS和大肠杆菌均可引起MyD88基因上调表达，6 h效果最佳;在中肠组织中，注射LPS 3 h 时MyD88基因表达量最高，注射大肠杆菌在6 h时条带亮度最亮。结果表明MyD88基因可能响应LPS和大肠杆菌引起的家蚕免疫表达反应。

关键词：家蚕;MyD88;注射;LPS;大肠杆菌

MyD88是机体内重要的转导蛋白，在信号转导途径中起到关键作用[1]。Lord等发现髓样分化基因家族的新成员MyD88，认为MyD88能够调节髓样细胞分化[2]。在哺乳类动物中，MyD88基因主要表达于T细胞、B细胞中[3]。

在家蚕中，MyD88基因在中肠（midgut，MG）、脂肪体（fat body，FB）、表皮（epidermis，EP）等主要免疫器官中的表达量相对其他较高[4]。MyD88是家蚕先天免疫通路Toll通路上重要的接头分子，研究表明，MyD88与活化的Toll受体的TLR结构域连接，再与Tube、Pelle蛋白结合成三聚体形式，从而实现信号细胞内传导[5]。

革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分为LPS（lipopolysaccharide），机体感染后会出现毒性反应，LPS作为大肠杆菌（Escherichia coli）细胞壁的主要成分，参与大肠杆菌引起的免疫反应[6]。Liu等研究发现LPS能够激起昆虫先天免疫反应，同时BmToll9-2基因在家蚕幼虫的不同组织参与LPS等外源病原体的识别过程[7]。然而，作为Toll通路的下游因子MyD88能否对LPS做出免疫反应，目前在家蚕中还未明确。

本文利用注射法，对家蚕5龄幼虫进行不同处理，通过凝胶电泳条带，分析MyD88基因在不同处理下的表达水平。本研究进一步揭示家蚕Toll通路中MyD88基因层面上免疫系统对特定外源物质的响应。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

本研究使用广东省农科院蚕业与农产品加工研究所提供的P50品系家蚕。孵化后的幼虫在25℃、60 %的相对湿度、光周期12L：12D条件下，以新鲜桑叶饲养。

1.2 家蚕幼虫的注射实验及解剖取样

对家蚕幼虫分别注射10 μLLPS溶液（2.5 mg/μL）和10 μL大肠杆菌稀释液（2.5 × 106 cells/μL），同时以注射等量无菌水作为阴性对照。在注射后的0、3、6 和24 h进行解剖取样，平行取样3组，所有样品迅速置于无RNA酶的离心管中，保存于-80℃冰箱备用。

1.3 RNA的提取和cDNA的合成

采用RNAiso Plus（TaKaRa）试剂盒，按其说明书提取总RNA，并用NanoDrop 2000检测，置于-80℃保存。参照PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）说明书，采用10 μL的反應体系;25℃ 10 min，42℃ 60 min的反应条件进行反转录。

1.4 PCR扩增和凝胶电泳

使用Primer Premier 6.0软件进行设计PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。内参基因选择BmActin基因，检测基因为MyD88基因。采用2 × Taq PCR MasterMix（艾德莱）试剂盒和20 μL的反应体系进行PCR扩增。扩增条件：94℃ 2 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，共33次循环;72℃延伸10 min。PCR产物进行1.5 %琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察实验结果。

2 结果与分析

2.1 不同处理后脂肪体组织中BmMyD88基因表达水平分析

通过凝胶电泳图分析，注射无菌水时，MyD88基因在0、3 h条带较暗，6、24 h的条带亮度相近（图1：A）;注射LPS时，MyD88基因在3 h的条带亮度明显增强，6 h达到最亮，24 h减弱到最暗（图1：B）;注射大肠杆菌，MyD88基因在3 h的条带亮度略微增强，6 h条带最亮（图1：C）。

2.2 不同处理后中肠组织中BmMyD88基因表达水平分析

通过凝胶电泳图分析，注射无菌水时，MyD88基因在0、3、6 和24 h的条带亮度相对一致（图2：A）;注射LPS时，MyD88基因在3 h的条带亮度明显增强，6、24 h逐渐变暗（图2：B）;注射大肠杆菌，MyD88基因在6 h的条带最亮，24 h的条带亮度减弱到与3 h相近（图2：C）。

3 讨论

本实验对家蚕5龄幼虫进行LPS注射，结果显示，注射LPS后MyD88基因均能在脂肪体和中肠中于不同时间段被诱导表达，中肠中效果更加明显。中肠作为细菌经口侵入家蚕体内的第一道防线，感染后能抗菌基因的表达，引起肠道免疫反应[8]，同时家蚕幼虫在5龄阶段接近变态发育，此时中肠的蛋白种类与数量提高，中肠活动十分旺盛[9]。

同时本实验进一步用大肠杆菌注射检验，对比发现，分析发现大肠杆菌较LPS诱导效果更佳、时长更久。推测由于大肠杆菌含有更多的LPS，另一方面同时大肠杆菌中含有与家蚕Toll通路中相互作用的活性物质，从而促进对家蚕MyD88基因的诱导表达[10]。

哺乳动物中TLR4被LPS激活后会引起早期的MyD88依赖型信号通路[11]，昆虫的Toll9具有和哺乳动物TLR4在进化上相对保守，结构相似[12-13]。张若男等研究发现，BmToll9蛋白在家蚕响应LPS的免疫途径与哺乳动物中响应LPS的蛋白受体TLR4极其类似[14]，推测家蚕Toll通路中MyD88基因也能被LPS激活，参与LPS和大肠杆菌引起的免疫应答反应。

综上所述，注射LPS和大肠杆菌激起家蚕幼虫MyD88基因上调表达，揭示含LPS的革兰氏阴性菌能够激起家蚕的免疫反应，MyD88基因可能参与昆虫Toll通路对LPS等外源病原体的识别过程。为明确MyD88基因在家蚕先天免疫Toll通路系统中的作用，还需通过基因敲除等手段进一步研究。

参考文献

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[2]  宾运梅. 猪MyD88基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达[D]. 四川：四川农业大学，2009，13-17.

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[9]  王延穩，吕志强. 家蚕肠道感染细菌后6种抗菌肽基因表达的变化[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2016，80（01）：185-191.

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[11]  Liu J，Smagghe G，Swevers L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori[J]. Journal of Insect Physiology，2013，59（6）：646-654.

[12]  Imler J L，Zheng L. Biology of Toll receptors：Lessons from insects and mammals[J]. Journal of Leukocyte Biology，2004，75（1）：18-26.

[13]  Luo C，Zheng L. Independent evolution of Toll and related genes in insects and mammals[J]. Immunogenetics，2000，51（2）：92-98.

[14]  张若男. 家蚕BmToll9和BmMLs响应LPS引发的免疫反应[D]. 华南农业大学，2016，43.

项目名称：“攀登计划”广东大学生科技创新培育专项资助。