细胞周期蛋白家族基因在家蚕幼虫蜕皮过程中的表达

刘丽华++沈卫德++李兵

摘要：细胞周期蛋白（cyclin）是调控真核生物细胞有丝分裂的重要蛋白。以家蚕1～5龄幼虫的眠蚕和起蚕为材料，采用实时荧光定量PCR方法对家蚕cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在不同龄期幼虫蜕皮过程中的表达进行研究。结果显示，1龄幼虫在眠期、起蚕期几乎均检测不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表达，表明此时幼虫器官发育基本完成，细胞分裂迟缓。在起蚕期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均随着幼虫的发育进程逐渐增加，表明细胞分裂过程加剧，促进家蚕个体的不断生长；眠期则没有规律性变化。在2～5龄幼虫中，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均为起蚕期高于眠期，眠期最重要的生理过程是细胞凋亡，因此眠期细胞周期蛋白家族基因表达水平较低，而CyclinB3基因在整个幼虫时期几乎不表达。本试验结果为细胞周期蛋白在家蚕蜕皮变态发育过程中的调控机制研究提供了参考。

关键词：家蚕；细胞周期蛋白；家族基因；幼虫；表达谱

中图分类号： Q786文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0045-02

细胞周期主要受细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖激酶（cyclindependent kinase，CDK）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）在G1/S期和G2/M期2个限制点的调控[1]。其中，CDK是真核生物细胞周期调控的关键因子，依赖Cyclin发挥其功能。Cyclin 的表达具有典型的周期性和时相特异性，可作为调节亚基与相应的CDK形成复合物，并正调节CDK的活性。不同Cyclin在不同时相可通过相应的CDK促进完成细胞周期[2]。

Cyclin广泛存在于多种生物体内[3-4]，在哺乳动物细胞中已发现20多种细胞周期蛋白家族成员[5]，在家蚕体内已发现6种。CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1、CyclinH 均是家蚕细胞完成细胞周期必不可少的。有研究表明，CyclinA在S期、G2期到M期的转变过程中发挥作用[6]；CyclinB 和CyclinB3同属于B型周期蛋白，是M期的限制因素[7]；CyclinE是G1期向S期转变中最重要的周期蛋白[8]；CyclinL1、H可能对细胞周期起调控作用[9-10]。

家蚕属于完全变态发育昆虫，一生要经过卵、幼虫、蛹、成虫4个形态和机能完全不同的发育阶段[11]。幼虫是摄取营养、快速生长的发育阶段，幼虫期每个龄期之间都要经历眠期和蜕皮的过程，不同发育阶段的细胞均要进行重组和分化，此过程必然受到Cyclin的调控。采用RT-PCR方法，在家蚕 1～5龄眠蚕和起蚕不同发育时期，研究直接影响细胞增殖分化的家蚕Cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在蚕体的转录特征。本试验结论为Cyclin在家蚕蜕皮变态发育过程中的调控机制研究提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1家蚕供试家蚕品种为大造，由苏州大学蚕桑实验室保存，于（25±1） ℃、相对湿度60%～75%条件下，用新鲜桑叶饲育。分别取家蚕1～5龄眠蚕、起蚕各10头，雌雄各半，冻存于液氮中备用。

1.1.2主要试剂总RNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，M-MLV反转录试剂盒、SYBR PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒、其他化学试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2方法

1.2.1家蚕总RNA提取及cDNA制备按照Trizol试剂盒说明书分别提取家蚕1～5龄眠蚕、起蚕的总RNA，采用紫外分光光度计测定其纯度和质量浓度。采用M-MLV反转录试剂盒将提取的1～5龄眠蚕、起蚕总RNA分别反转录为cDNA。

1.2.2实时荧光定量PCR按照Real-Time PCR的要求，采用Primer 5.0软件设计Actin3内参基因及CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的引物（表1）。以合成的cDNA为模板，采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒对各基因进行实时荧光定量PCR扩增，具体步骤按照试剂盒说明书进行。反应体系为20 μL，反应程序为：95 ℃变性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，40个循环。反应过程由ABI 7300型测定仪软件自动设定，每个样品重复3次。

1.2.3标准曲线的制作分别将CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、Actin3基因以10倍梯度稀释为6个质量浓度梯度，进行Real-TimePCR。以所得循环阈值（CT值）为纵轴，以表1检测基因与内参基因的引物

1.2.4数据处理采用ABI 7300型仪器自带的Sequence Detection Software Version 1.3.1软件处理RT-PCR的结果数据，并参照Schefe的方法[12]进行效率校正。采用SPSS 16.0软件制作图表。

2结果与分析

2.1总RNA纯度和质量浓度的测定

提取各组织总RNA的D260 nm/D280 nm比值均在1.8～2.0，表明所提取总RNA的纯度较高，无基因组、蛋白质、其他杂质污染。所提取总RNA的质量浓度为1.1～2.8 μg/μL。

2.2Cyclin家族基因在家蚕幼虫不同时期的表达

细胞周期蛋白家族基因在家蚕幼虫各发育时期的表达情况见图1。1龄幼虫在眠期、起蚕期几乎均检测不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表达。在起蚕期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均随着幼虫的发育进程逐渐增加，4龄起蚕达到最大值，5龄时稍有下降；眠期则没有规律性变化。在2～5龄，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均为起蚕期高于眠期，而CyclinB3基因在整个幼虫时期几乎不表达。

3结论与讨论

昆虫蜕皮是复杂的生理生化过程。已有研究表明，昆虫蜕皮、变态发育过程是在蜕皮激素与保幼激素的协同调控下，大量基因按照一定的时间、空间次序被诱导或抑制表达而实现的。从细胞周期蛋白家族基因表达的变化探讨蜕皮过程，可促进昆虫蜕皮分子机制的深入研究。

本研究结果显示，家蚕幼虫无论是眠蚕还是起蚕，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在1龄幼虫几乎均不表达。可见，家蚕由受精卵发育至1龄幼虫时，幼虫器官基本发育完成，因此细胞分裂迟缓，这与笔者前期试验中Cyclin家族基因在家蚕胚胎期的表达结果相同。与起蚕期相比，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在眠期的表达量均较低。可能的原因为，眠期的主要生理活动是蜕去旧表皮、形成新表皮，此期维持生命活动所需的营养物质和能量主要由贮藏在脂肪体中的营养物质代谢产生；细胞凋亡是此期最重要的生理过程，因此Cyclin家族基因表达水平较低。在起蚕期，Cyclin家族基因（CyclinB3基因除外）表达水平随着幼虫龄期推进持续增加，表明细胞分裂过程加剧，促进家蚕个体不断生长；至4龄起蚕达到小高峰，之后稍有下降，家蚕生殖器官在3龄末至4龄初迅速发育，从而进入成熟期[13]。笔者前期对Cyclin家族基因的定量研究表明，其在生殖细胞中均显著表达[14]，这可能是导致CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量增加的原因。

CyclinB、CyclinB3基因是家蚕细胞周期M期的限制因素。在本试验中，CyclinB3基因在眠期和起蚕期几乎均不表达，表明CyclinB基因在幼虫蜕皮过程中起主导作用，而CyclinB、CyclinB3基因对细胞周期调控作用的不同之处有待进一步研究。

参考文献：

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[13]向仲怀，黄君霆，夏建国. 蚕丝生物学[D]. 北京：中国林业出版社，2005：12-14.

[14]刘丽华，沈卫德，李兵，等. 家蚕细胞周期蛋白家族基因在5龄幼虫组织中的表达谱分析[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（11）：13-17.龚丽，李云霞. 一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因的克隆、表达和酶学特性[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：47-50.