脂肪酶工程菌构建、表达、纯化及酶学性质分析

王景乐

摘要：脂肪酶属于丝氨酸水解酶，可以在油水界面把甘油三酯水解成甘油及脂肪酸，对于脂合成、脂水解、脂交换等众多反应具有重要的催化作用。因而，脂肪酶不仅在生物体的代谢中起重要作用，脂肪酶广泛存在于植物、动物以及微生物中。但天然的脂肪酶通常具有產量低、稳定性差等诸多缺点，无法满足工业生产的需求。因此，利用基因工程对于脂肪酶的酶学性质进行改造，提升其催化能力与反应稳定性，生产高产的脂肪酶工程菌，具有重要的意义。

关键词：脂肪酶工程菌;构建;纯化;酶学性质

中图分类号：0939.9

文献标识码：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2019.09.028

0 引言

在许多生产领域中，催化剂都必不可少。与传统的化学催化剂相比，脂肪酶作为一种生物催化剂拥有高度催化特异性，而且其对于原料的要求低，带来的副反应少，有助于提高产品的品质。同时，利用脂肪酶作为催化剂还能起到减少产生有毒副产物和能源消耗的作用，具有广阔的应用前景。目前，脂肪酶的获得主要是通过基因工程的方法，选择合适的表达体系构建脂肪酶工程菌，并对经过改造后重组的脂肪酶进行纯化，提高其纯度，同时研究其酶学性质找到能对重组脂肪酶活性产生影响的关键因素，进而生产出能满足应用需要的脂肪酶。

1 构建与表达

目前可以作为外源性蛋白表达系统的包括酵母、动植物细胞、细菌以及昆虫细胞等。而脂肪酶作为一种活性蛋白质，用于脂肪酶工程菌的构建，脂肪酶基因的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、枯草杆菌表达系统等。

1.1大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统是外源性脂肪酶基因应用最早的表达系统。该表达系统具有繁殖快、使用范围广泛、产量高以及易纯化等众多优点，主要包括非融合型与融合型2种表达载体。在大肠杆菌表达系统中，选择合适的表达宿主菌是一个关键的因素，需要考虑不同宿主菌的独特表达特点，以确定其是否合适。如大肠杆菌BL21，其是为添加T7噬菌体设计的，在T7噬菌体转录中可以通过合酶的作用，将细胞绝大部分的营养用于表达外源脂肪酶基因。而表达载体也是大肠杆菌表达系统在表达外源基因时不可或缺的，表达载体通常涵盖启动子、克隆位点、基因片段、转录标签、终止子以及操纵子等。质粒是大肠杆菌表达系统主要的表达载体，pET系列是大肠杆菌表达系统中应用比较广泛的载体。此外，外源基因结构也是大肠杆菌表达系统中的关键要素。大肠杆菌是原核细胞，可以直接表达原核基因;真核基因则需要结合大肠杆菌的喜好进行基因片段优化，去掉内含子。关于大肠杆菌表达系统成功表达外源性脂肪酶基因的研究成果有很多，CALB是一种底物谱广泛且催化活性高的脂肪酶。2006年首次在大肠杆菌周质中成功表达。通过乳糖启动子的控制，CALB的酶活力可以保持在2U/mg，与不同的分子伴侣还可以达到CALB融合表达的效果，在质粒pGr07中其最高的酶活力可以达到61U/mg。但作为一种原核生物，大肠杆菌不具备真核生物的蛋白质加工修饰能力以及基因表达调控机制，大肠杆菌表达系统在复杂的蛋白质表达中效果有限，因而在脂肪酶工程菌的构建，脂肪酶基因的表达存在一定的局限性[1]。

1.2毕赤酵母表达系统

与大肠杆菌不同，酵母是一种最简单的真核生物，拥有大肠杆菌没有的基因调控机制。最早被作为外源基因表达真核宿主菌的酵母是S.cerevisiae，但由于S.cerevisiae在表达重组蛋白的过程中出现表达质粒易丢失、菌株不稳定、分泌效率差等缺陷。因此，新的毕赤酵母表达系统被开发出来，成为脂肪酶基因表达较为理想的系统。毕赤酵母具有生长繁殖快、高密度发酵、易于培养以及便于基因工程操作等突出的优势。同时，毕赤酵母还可以正确翻译，并加工修饰外源真核基因。毕赤酵母可以将甲醇当作唯一碳源，在单细胞蛋白表达生产中是极具价值的有用菌株。较早在毕赤酵母表达系统研究中取得突破的是飞利浦石油公司与SIBIA。毕赤酵母表达宿主菌也也有多种，如GS115、X-33、MP-36、KM71等。在毕赤酵母表达系统的表达载体方面，其启动子有诱导性的FLDI、LCL1、AOX1、YPTI以及组成型的GAP等，而pAOXl是最为常用的启动子。

2纯化

纯化是将发酵液中的生物杂质去除，提高纯度，以避免这些生物杂质对于酶促反应产生不利影响的关键环节。同时，脂肪酶酶学性质的研究也要用到纯酶，以便获得更具有可靠性的数据，将其他干扰因素排除。

目前，蛋白质分离纯化技术已经得到突破性的发展，为脂肪酶的纯化提供了必要的技术支持。天然蛋白的分离纯化会经过4个甚至更多的步骤获得纯度较高的酶。常规的方法有离子交换层析、凝胶过滤层析、硫酸铵分级沉淀、反胶束溶剂提取等。分离中，步骤越多则表示酶的收率越低，成本也越高。对于脂肪酶的分离纯化，传统的方法步骤复杂且成本高，而基因工程技术的发展为脂肪酶纯化提供了广阔的空间。通过在毕赤酵母、大肠杆菌等表达系统中的异源表达后，不仅提高了脂肪酶的产量，而且进一步分离纯化也更加有利。在构建与表达中，可以通过在酶蛋白的N端、C端添加标签，就可以借助与添加的标签减少纯化步骤，进而提升纯化效率。在分离纯化中，可以通过组氨酸标签，采用镍离子亲和层析对脂肪酶进行分离纯化。分离纯化过程主要包括以下几个关键的步骤：一是对于发酵上清液进行微滤除杂;二是将经过微滤的滤过液利用酶膜反应器进行超滤浓缩;三是进行Ni柱亲和层析;四是通过透析袋进行脂肪酶液的透析;五是将分离纯化的酶液进行冷冻干燥，以便应用于酶学性质的分析中[2]。

3酶学性质

了解脂肪酶的酶学性质是将其研制成生物催化剂应用于食品工业、生物制药、洗涤行业、生物能源、饲料工业等各个领域的基础。脂肪酶的种类多种多样，不同类型的脂肪酶所具有的酶学性质存在很大的差别，因而通过基因工程技术制备FJ重组脂肪酶必须进行酶学性质的研究。通常脂肪酶的酶学性质主要体现在其受到温度、pH值、表面活性剂、金属离子、酶促反应动力学等的影响上。

3.1 最适pH及pH稳定性

溶液的pH值是对大多数酶的活性产生影響的重要因素，包括脂肪酶。脂肪酶在某一个pH值下，酶的活力达到最大则是其最适pH。当溶液的pH值偏离脂肪酶的最适pH越远，其酶的活性就会越小，无论是过酸还是过碱都会导致脂肪酶完全失活。重组脂肪酶最适pH及pH稳定性的研究通常需要配置pH值不同的缓冲液，将纯酶添加到不同的缓冲体系中，测定其水解活力，最终得到最适pH及pH稳定性特征。

3.2最适温度

在生产中，温度会对脂肪酶的催化反应产生影响。掌握在不同的温度下脂肪酶的活性及热稳定性，才能制备出满足不同温度条件下生产需要的脂肪酶生物催化剂。通常温度对于脂肪酶的影响是多方面的，在低温条件下，脂肪酶的活力比较弱，随着温度上升脂肪酶的活性会出现相应的提升。而当温度超过最适温度值后脂肪酶的活性会逐步下降，并最终由于蛋白构象出现热变性而使脂肪酶彻底失活。最适温度反映的是脂肪酶酶促反应速度最大、活性最高的温度。

3.3金属离子对活性的影响

金属离子浓度不同，脂肪酶的活性也会出现相应的变化。低浓度时，大部分的金属离子对于脂肪酶都具有促进作用，酶活性保持在一个较高的水平;而金属离子的浓度过高，则会对脂肪酶的活性造成抑制，使其活性下降。对重组脂肪酶活性产生重要影响的金属离子主要有C a2+、Ni2+、C02_、Li+、Mg2+、Mn2+，B a2+等。可以根据其性质，在保证不影响反应需求的基础上，添加可增加脂肪酶活性的金属离子，达到提高反应效率的目的[3]。

4结束语

在脂肪酶工程菌的构建与表达中，全面掌握大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统的应用，了解脂肪酶制备过程中分离纯化的前沿技术，并正确把握脂肪酶工程菌的最适pH、最适温度、不同浓度的金属离子的影响等酶学性质的研究手段，对于脂肪酶生物催化剂的生产及其在社会各个领域中的应用具有重要的意义。

参考文献

[1]朱婧.稻米脂肪酶基因工程菌的构建及性质研究[D].长沙长沙理工大学，2014

[2]朱婧，谢定，文李.展示在毕赤酵母表面稻米脂肪酶的性质研究[J].食品与机械，2014（3）：13-15.

[3]刘松脱氧核糖醛缩酶的基因工程菌构建与表达及初步应用 研究[D].南昌：南昌大学，2014