荧光分光光度法测定芩连合剂中小檗碱的含量

2019-10-21李易珍林庚庭

中国中医药现代远程教育 2019年19期

冯海李易珍林庚庭

（1 浙江工业大学药学院，杭州浙江 310014；2 解放军117 医院门诊部，浙江杭州 310004）

中药在治疗胃溃疡上积累了丰富的临床经验，具有疗效明确、复发少，毒副作用少等特点。芩连合剂是来源于《伤寒杂病论》中的经验方半夏泻心汤结合临床实践加量或减量而成的，由黄连、黄芩、佛手、三七粉、玄胡、干姜、制半夏组成。具有消瘀、止痛、理气、泻热等作用，其中君药为黄芩。研究表明芩连合剂在治疗慢性胃溃疡上，不仅能降低由幽门螺旋杆菌导致的溃疡程度，还能促进溃疡灶肉芽组织和溃疡灶表面黏膜的生长，以此来加速溃疡的愈合［1-2］。中药复方提取物成分复杂、难以分离，中药复方合剂中小檗碱含量的测定方法如紫外分光光度法、高效液相色谱法等具有背景干扰大，组分容易分离不彻底，导致含量测定时误差较大，我们发现小檗碱的共轭结构使其在特定的波长下能发出荧光，从而大大减少了其他组分对其测定的干扰，选用以荧光分光光度法测定小檗碱含量作为提取物含量的指标，具有灵敏度高、选择性强的特点，适用于芩连合剂中小檗碱的含量检测［3］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 PHS-25 pH 计（上海越平）、LQ-A3003 电子天平（瑞安市安特称重设备有限公司）、SHZ-D 循环水式多用真空泵（上海锦赋实验仪器设备有限公司）、HJ-4 磁力加热搅拌器（金坛市城东新瑞仪器厂）、Syneray H1 酶标仪（美国伯腾有限公司）、Waters 2695 液相色谱仪。

1.2 试药小檗碱标准品（上海纯优生物科技有限公司）、氢氧化钠（分析纯，杭州萧山化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津化学试剂公司），甲醇（色谱纯，天津化学试剂公司），芩连合剂（浙江中医药学院附属门诊部自制）。

1.3 指标确定方法

1.3.1 最佳激发波长和发射波长的确定激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。称取盐酸小檗碱标准品0.025 g，加水溶解，用饱和氢氧化钠溶液调节pH=12.5，置于100 mL 容量瓶中定容，配置成250 μg/mL 的盐酸小檗碱标准溶液，通过改变激发波长，寻找最佳发射波长；在确定的最佳发射波长下，扫描激发波长，最终确定最佳激发波长和发射波长［3］。

1.3.2 最佳介质pH 的确定称取小檗碱0.025 g，用水溶解，用饱和氢氧化钠溶液调节不同的pH（9～13），后置于100 mL 的容量瓶中定容，在上述的激发波长和发射波长下分别测定其相对荧光强度。

1.3.3 标准曲线的制作称取小檗碱标准品0.0110 g。用水溶解，用饱和氢氧化钠调节pH=12.5，置于100 mL 容量瓶中定容，配置成100 μg/mL 的小檗碱标准溶液［4］，将其按梯度稀释成5、15、25、35、50 μg/mL 的小檗碱标准溶液，在特定的激发和发射波长下分别测定其荧光强度并绘制小檗碱标准溶液的标准曲线。

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度考察精密称取小檗碱标准品0.0102 g。用水溶解，用饱和氢氧化钠溶液调节pH=12.5，置于100 mL 的容量瓶中定容，在最佳的激发波长和发射波长的条件下，测定其荧光强度，平行测定6 次，计算平均荧光强度和RSD。

1.4.2 日内稳定性用上述配置的100 μg/mL 的小檗碱标准溶液，在最佳的激发波长和发射波长的条件下，每间隔2 h 测定一次荧光强度。

1.4.3 加样回收率精密吸取已知含量的样品溶液（14.6 μg/mL）9 份，每份1 mL，分别加入浓度为样品浓度的80%、100%、120% 的小檗碱对照品，混合，调节pH，测定其荧光强度，计算平均加样回收率。

1.5 样品测定和比较取芩连合剂药粉适量，以水作为提取溶剂，料液比1∶12，提取次数2 次，加热回流1.5 h，过滤得提取液，用饱和氢氧化钠溶液调节pH=12.5，在最佳的激发和和发射波长下分别测定其荧光强度，计算每1 g 药粉中小檗碱的含量。并与中国药典2015 年版第2 部中盐酸小檗碱液相色谱法进行对比试验（色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液［0.05 mol/L 和0.05 mol/L 庚烷磺酸钠溶液（1∶1）含0.2% 三乙胺，并用磷酸调节pH 至3.0］-乙腈（60∶40）为流动相，检测波长为265 nm）［5-6］。

2 结果

2.1 激发波长和发射波长的确定

2.1.1 最佳发射波长的确定通过改变激发波长，扫描发射波长，得到发射图谱，当激发波长为395 nm 时，最佳发射为523 nm，相对荧光强度为2950；当激发波长为400 nm，最佳发射波长为522 nm，相对荧光强度为3030；当激发波长为405 nm，最佳发射波长522 nm，相对荧光强度为3006。故可以得到小檗碱在此条件下的最佳发射波长为522 nm。见图1。

图1 发射图谱

2.1.2 最佳激发波长的确定确定发射波长为522 nm，扫描激发波长，得到激发图谱，当发射波长为522 nm 时，最佳发射波长为400 nm。综上，荧光分光光度法测定小檗碱含量的最佳激发波长为400 nm，最佳发射波长为522 nm。见图2。

图2 激发图谱

2.2 最佳pH 条件的选择在激发波长400 nm，发射波长522 nm 的条件下分别测定溶液不同pH 时的荧光强度，当pH=12.5 时，小檗碱标准溶液的荧光强度最强，有最大荧光强度为3928，RSD 为1.9%。因此，选择pH=12.5作为待测溶液的最佳pH。其可能的原因是在碱性情况下游离碱形态的小檗碱π 电子的共轭体系要大于在酸性和中性条件下的阳离子形态的盐酸小檗碱。见图3、表1。