气相-离子迁移谱联用技术评定大米霉变程度的应用研究

谷 航 陈 通 陈明杰 陆道礼 陈 斌

(江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013)

稻谷作为第二大谷物，全国有超过65%的人口把它作为主食，政府机构每年都需要储备大量大米以保障粮食供给安全，稳定调节市场平衡，应对自然灾害和突发事件，保证社会稳定[1]。大米在储藏过程中易受霉菌的侵染，使其品质发生劣变，同时霉菌的次级代谢产物对人畜健康危害极大，若能在霉变早期发现并及时处理，将大大降低大米霉变导致的经济损失[2-3]。

霉变的常规理化分析方法具有操作步骤复杂、耗时长、灵敏度差等缺点，无法实现快速、无损的检测需求。随着色谱、光谱技术的不断发展，粮食行业对霉变的辨别开始转向针对霉菌生长代谢产生的物质，如霉菌毒素、霉变挥发性有机物(Microbial Volatile Organic Compounds,MVOCs)的检测[4]。目前检测霉菌毒素常用的方法有薄层色谱法、高效液相色谱、液相色谱-质谱联用技术、酶联免疫技术等[5-7]。这些方法大都需要样品经过复杂的前处理，操作繁杂、耗时久[8]。微生物挥发性有机化合物(MVOCs)指的是细菌和真菌在生长繁殖的过程中产生的初级或次级代谢挥发性化合物，被认为是微生物生长的评价指标，在临床诊断和环境监测中被广泛应用，近年正逐渐成为研究微生物污染的新型有效手段[9-10]。

气相色谱与离子迁移谱联用技术(GC-IMS)是近年来新出现的一种技术，相比电子鼻与气相色谱-质谱联用(GC-MS)，GC-IMS在挥发性有机物痕量检测方面显露出装置简单便携、高灵敏度、无须样品处理等的优势[11]。目前该技术用于食品方面的应用研究主要集中在食用油、蜂蜜、茶叶的质量评估等方面，而在大米霉变预测领域研究相对较少[12-15]。

本研究采用GC-IMS技术对霉变大米在不同霉变阶段产生的特征性挥发性气味物质进行检测分析，遴选出用于表征霉变过程的特征指纹谱，并采用主成分分析(PCA)降维，通过聚类分析探讨GC-IMS技术用于大米霉变程度的快速评定方法和进行早期预警的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

散装清峰大米(镇江丹阳):市售。3种霉菌：黑曲霉(A)、变幻青霉(B)、寄生曲霉(C)均从霉变大米上筛选鉴定获得。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec 1H1-00053型气相色谱-离子迁移谱(配CTC CombiPAL自动顶空进样装置)；CLOT毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.50 μm)。

1.3 方法

1.3.1 人工霉变样品的制备

将前期筛选鉴定过的黑曲霉、变幻青霉和寄生曲霉3种霉菌分别制备成孢子悬浮液，浓度为107～108CFU/mL。取1mL孢子悬浮液均匀喷洒至5g大米上，放入恒温恒湿培养箱(35 ℃、90%RH)中进行培养，每隔4 h取样检测1次，以正常大米作为空白样本，共25个样本。

1.3.2 自然霉变样品的制备

大米在储藏期间容易受到霉菌的侵染，当温度在25～40 ℃时，黄绿青霉、黄曲霉、灰绿曲霉等开始活动，导致大米霉变[16]。研究选用了江苏本地大米作为研究对象，含水率控制在14.03%左右。通过预实验发现10 g大米在恒温恒湿培养箱中(35 ℃、90%RH)放置3个月后霉变明显，而最初开始的1个月基本没有变化[17]。因此对实验样本的制备进行了优化，前期集中放样，逐步拉长放样时间，当最开始的大米发生霉变即可停止放样，集中进行检测，具体的实验过程为：每次称取本地大米10 g置于直径60 mm培养皿中，标上日期放入恒温恒湿培养箱中(35 ℃、90%RH)，剩下的大米密封放入冰箱保存。从6月11日起开始制备样本，前20 d连续放样，然后每隔2、3、5、7、12 d放样1次，各持续2次，当最早放置的大米表面失去光泽、变黄，出现“起眼”、“起筋”现象且有明显霉味时停止放样，最后将放入冰箱保藏的大米作为对比样本，共制备31个不同存放期的大米样本并集中在同一时间内集中检测。

1.3.3 GC-IMS检测条件优化

本实验以霉变大米为样品进行参数优化，分析一些主要特征峰的峰强来选择最优的实验条件。每个样品称取5 g于20 mL的顶空样品瓶中，标记后放入自动进样器的样品槽中，设置仪器的相关参数后，即可开始检测。

经参阅资料发现对于不同实验，色谱柱与漂移管温度的变化对出峰信息量影响不大。因此，本实验主要对孵化温度、孵化时间、进样量、漂移气和载气的流量等参数进行优化。在优化某参数时，其他参数保持不变。

1.3.3.1 孵化温度的选择

参考已有的研究结果并考虑到孵化温度不能超过进样针温度(80 ℃)，将孵化温度的优化区间定为40～70 ℃。由实验结果可知随着温度的上升，特征峰的强度都逐步增加，在60 ℃时达到顶峰；当温度上升到70 ℃色谱峰强度反而下降，主要原因为温度过高可能会导致某些化合物热分解。因此，最终选取60 ℃为最优的孵化温度。

1.3.3.2 孵化时间的选择

在孵化温度60 ℃条件下，分别将孵化时间设置为5、10、15 min后，进行GC-IMS分析，结果发现，与孵化5 min相比，孵化10 min得到的特征峰的强度有所增加，当孵化时间增加到15 min时，峰强基本不变，说明该时间点顶空气体成分已经达到了平衡点，不会再有新的挥发性物质产生。因此，选取10 min为本研究最优的孵化时间。

1.3.3.3 进样量的选择

本研究所用仪器默认进样量参数值为0.2 mL，考虑到样本为固体，并参考已有的相关文献报道，设置进样量的优化区间分别为：0.2、0.5、0.8、1 mL。随着进样量的增加，特征峰的强度逐渐增加，但是由于仪器的检测上限过低，当进样量到达0.8mL时仪器开始出现过饱和现象，因此，最佳的进样量为0.5 mL。

1.3.3.4 漂移气和载气流量的选择

经查阅相关文献，漂移气流量的增加对峰值强度基本没有影响，因此，采用仪器的默认流量：150 mL/min。载气流量的大小和稳定性对色谱峰的分离有很大影响，GC-IMS联用仪可以在分析过程中按一定速率提高流量，通过预实验发现，相比较于恒定流速，程序控流能够获得更好的分离效果，因此本实验采用程序控流，具体程序设置参照表1。

表1 仪器参数条件

1.3.4 特征峰选取

样品的GC-IMS三维谱特征峰选取原则：GC-IMS三维谱中每个特征峰代表1种挥发性有机成分，以样品的特征峰有无或者特征峰强度变化为原则，手动选择并以长方形标记特征峰所在区域，以该特征峰区域的峰高值(即特征区域离子强度的最大值)作为参数变量进行数据分析。

1.3.5 数据分析处理

GC-IMS在正离子模式下采集的三维谱数据传输并保存到计算机中，每张谱图平均扫描32次，使用网格脉冲宽度为100 μs，重复率为21 ms，采样频率为150 kHz。

软件采用 LAV2.2.1和Matlab R20R2009b进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 霉变大米GC-IMS谱图分析

在GC-IMS图谱中，不同的挥发性有机化合物在图谱中响应信号的位置不同。在设备检测范围内，挥发性有机化合物的浓度越高，在图谱中的信号响应越强。依据特征峰选取原则，将选取的不同有机挥发性物质对应的特征峰区域进行排序对照，结果如图所示。图1为分别被3种不同霉菌感染的大米的检测结果。

由图1可知，虽然接种的霉菌种类不同，但是所对应的特征峰的变化趋势整体一致，如标识号1的特征峰的强度与储存时间成正比，6号特征峰强度先增加后减少，其他特征峰的强度则随着储存时间的增加呈现不同程度减弱的趋势。通过谱库检索数据库知1号特征峰为1-辛烯-3-醇、6号特征峰为正己酸的出峰，而这两者都是霉菌产生的特征挥发性有机化合物[18]，而其他物质可能是大米自身特有的气味，随着时间的延长浓度被逐步稀释。选取出的部分特征峰谱库检索结果如表2所示。

注：横坐标“1～21”代表选取的特征峰标示号，纵坐标标示号中A、B、C分别代表黑曲霉、变幻青霉、寄生曲霉，后缀表示培养时间序列。图1 接种不同霉菌的大米在不同培养时间下所对应的特征峰的图片库

注：横坐标0～84 d代表样品的存放时间，随着存放时间变长，霉变程度也增加，纵坐标“1～21”代表选取的特征峰标识号，该特征峰位置信息与图1选取的特征峰相同。图2 不同存放时间的大米对应不同特征峰的图片库

表2 部分特征峰对应的化合物名称

图2是不同存放时间的大米对应不同特征峰的图片库。结合图1与图2可发现，正常大米样品随着存放时间的增加，1号特征峰强度也呈增加的趋势，表明霉菌生长代谢产生的1-辛烯-3醇浓度逐步增加；6号特征峰强度先增加后减少，与图1结果一致；而其他特征峰的强度逐步降低，表明大米自身的某些香气物质逐渐消失(如：庚醛、己醛[19])。随着霉变程度的增加，营养物质的流失，样本图谱上特征峰的数量骤减，仅存在霉变产物所对应的特征峰。通过对原始图谱中不同特征峰进行简单的排列比较，可以初步将自然霉变的大米样本拟划分为4个时期：正常大米、霉变早期、霉变中期、霉变后期[20]。

2.2 PCA分析

通过选取的不同特征区域的特征峰的组合对比排序大致可对霉变程度进行划分，但该划分方法仍受限于观察者的主观性，无法实现划分方法的数字化表达。因此，需结合化学计量学方法进一步分析。以选取的特征峰对应的峰强度值为特征参数变量，采用主成分分析PCA进行降维分析。

图3为使用PCA分析得到的第一、二主成分图与载荷图得分图描述的是样本的线性投影，代表了数据方差的主要部分[21]。结果表明，第一主成分和第二主成分的累计贡献率之和达95%以上，说明第一主成分、第二主成分可以表征选取的特征峰的绝大部分信息。由图3可知，不同霉变时期的大米样品均有其自己的归属区域，表明PCA方法可以有效将大米的霉变程度进行有效的区分。图中霉变中期与后期相隔较近的主要原因是样品间的放样时间仅间隔1 d，存在一定的检测误差。图3中存放74 d的样品被划分在霉变后期，属于异常值，可能产生的原因是样品本身带菌量较高。

注：数字代表样本的编号。图3 大米样本的主成分得分与载荷图

数据的主成分载荷图显示了特征在主成分上的投影，可用于研究特征的相关性和重要程度。其中载荷图中相应主成分的载荷大小反映了建立模型时特征的重要性，离原点坐标越近，特征的重要性越低。由图3可知编号为1、4、6、7、11、13、18对应的特征峰离原点较远，是样品的重要表征参数。两载荷向量的夹角是特征间相关性的描述，夹角越小，表明两个特征之间相关性越高，即可用一个特征来表示。图3中的1号与6号特征峰、13号与14号特征峰以及其他夹角较小的特征峰，它们之间具有较高的相关性。1与16号特征峰是逆相关的，而它们与2号特征峰相互正交，说明非相关，同理可以分析其他特征峰的相关性。载荷图表明，前期对特征峰的选取可能不够具有代表性，某些特征峰存在的意义不大，另一方面也可能是正常大米和早期霉变样品品质差异不明显导致区分不明显。选取具有代表性的特征峰主要是：1、4、7、10、11、13、17、19和21号峰。其对应的物质分别为：1-辛烯-3-醇、丁酸乙酯、叶醇、糠醇、正戊醇、戊醛，这些物质可以作为判断大米霉变程度的标志性物质。图3中样本与载荷向量的接近程度反映了该特征在建立主成分模型中的重要程度，而载荷向量的方向能有效地判断特征的区分能力。如1、4与13号特征峰可以对霉变早期大米与霉变中后期大米进行明显的区分，但是正常大米与霉变早期大米间的特征变量离坐标系原点较近，且特征两两之间夹角较小，相关性较高，重要程度较低，不能进行较好的区分，霉变中期与霉变后期间特征变量较少，但仅存的两个特征编号1和6能够进行一定的区分，但仍然存在归属区域不明确的现象。因此，需要进一步采用化学计量学方法建立模型进行判断识别。

2.3 聚类分析

聚类分析属于无监督模式识别，即数据没有类别标记，通过某种算法(如欧氏距离)将数据归为不同的类，基本原则是要相近的数据尽量归为一类，而不同类之间的数据则要尽量有比较大的差别[22]。聚类算法有很多种，K-Means 是聚类算法中最常用的一种，要在聚类前指定分成的类别数。本研究采用K-Means算法将经过PCA降维处理过的数据分为4大类：正常大米、霉变早期、霉变中期、霉变后期，结果如图4所示。

图4 样本系统聚类分析结果

由图4可知，存放74 d的样品归属为霉变后期大米，虽然按放样时间估计属于霉变中期，但是其本身霉变程度达到后期，结合GC-IMS图谱中也可以发现存放74 d的样品的特征峰与霉变中期的大米的特征峰强度不一致，因此被判断为霉变后期。由此可知，GC-IMS联用技术结合化学计量学方法可以快速区分大米存储过程中霉变过程。

3 结论

实验采用GC-IMS技术研究了大米霉变过程中产生的挥发性有机成分的变化规律，结合人工接种霉变大米的谱图库对自然霉变大米的霉变程度进行了判别，初步构建了霉变大米的GC-IMS指纹图谱。运用化学计量学方法对其进行了聚类分析，结果表明通过GC-IMS联用技术依据大米中挥发性有机化合物可以对霉变进行有效的区分。得出利用GC-IMS联用技术可用于大米霉变过程的快速鉴定与早期预警是可行的结论。