体外模拟消化对苦荞面包黄酮及抗氧化的影响

马艺超 路 飞 马凤鸣 葛新宇

谢加豪1 何运辉1 张士豪1 张佰清1(沈阳农业大学食品学院1，沈阳 110866)(沈阳师范大学粮食学院2，沈阳 110034)

苦荞麦是一种药食同源的作物，能够起到抗氧化、降血糖、增强免疫力、抗癌、护肝、抗炎、抗过敏等功效[1]。苦荞中含有大量的黄酮类物质，同一品种的不同部位的黄酮含量差异较大。近几年，对于苦荞中黄酮类物质及其抗氧化活性的研究成为关注的热点，但是主要通过对苦荞原料中生物活性成分提取后进行研究，而活性成分提取主要使用有机溶剂提纯[2-3]。苦荞中黄酮有一部分是以结合态存在，通过单纯的有机溶剂提取黄酮类物质主要集中于对游离态抗氧化的研究，会低估苦荞的整体抗氧化能力，国内外只有少量研究将谷物中的结合态抗氧化物质考虑在内[4]。有研究表明，胃肠道消化等吸收代谢处理对黄酮类物质的释放及抗氧化活性也有显著影响，黄酮类化合物在胃肠道消化过程中可能与蛋白质酶相互作用，形成复合物改变二者的分子结构特征、功能以及营养特性，从而对抗氧化活性产生影响[5]。由于机体摄入食物后，生物活性成分会在胃肠道消化过程中发生降解或转化，使一部分营养物质不能够被机体完全吸收[8]。因此采用体外模拟消化的方法研究食物中功能性成分的吸收会更接近人体的营养物质利用情况。Baublis等[6]研究发现谷物在胃酸和胃肠消化酶作用下总抗氧化活性有显著提高；赵旭等[7-8]研究发现，消化过程对谷物的酚类和黄酮类物质具有显著的影响。研究均认为在评价谷物食品抗氧化活性时应考虑胃肠道环境[9-10]。模拟体外消化的方法具有时间短、操作方便，成本较低等优点。因此，通过该方法，可以更科学地判断食物在体内的抗氧化活性。

众所周知，苦荞必须经过热加工处理熟化后食用。烤制是苦荞热加工过程中的一种重要加工手段。研究表明，烤制后的苦荞面包经过胃肠消化后其黄酮类物质的含量及抗氧化活性与原料差异较大[14]。本实验采用体外模拟人体胃肠消化方法，研究不同烤制温度下的苦荞面包在不同消化阶段黄酮类物质含量及抗氧化能力的变化。以期为科学评价人体对苦荞面包的营养价值和抗氧化活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞粉(全粉、芯粉、麸皮粉)：四川凉山苦荞种植基地。选取凉山地区特有的“西荞1号”，将干净苦荞原粮进行破碎脱壳，脱壳后的苦荞粗粉和荞壳混合物进入机械振动筛，将苦荞颗粒粉和苦荞壳进行分离，脱壳至苦荞壳中不再有苦荞胚乳。苦荞籽粒除杂后进入筛选机分离出麸皮和麦芯，然后经过磨制的苦荞精粉通过筛出得到苦荞芯粉，最后剩余的麸皮经筛出后磨制得到苦荞麸皮粉，对未脱皮的苦荞籽粒直接磨粉得到苦荞全粉。所有的面粉均过60～80目的筛子。

胃蛋白酶(1∶3 000)、胰蛋白酶、无水乙醇(分析纯)、盐酸(分析纯)、福林-酚试剂、无水乙酸钠、芦丁标准品、没食子酸标准品、总抗氧化能力试剂盒(ABTS法)：北京鼎国生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HZQ-F恒温振荡培养箱；UV-5100型紫外-可见分光光度计；CZ-PHS-3E酸度计；SB25-12DTN超声波清洗机；SP21-318C酶标仪；3K15型高速冷冻离心机。

1.3 方法

1.3.1 苦荞样品的制备

称取苦荞面粉50 g，小麦粉200 g，加入30 ℃的温水100 mL，加入酵母粉5 g，盐2 g，放入和面机中揉成面团，然后将面团切割成每份30 g，放于28 ℃下静置5 min，然后将其放在相对湿度为70%的醒发箱中，发酵约1.5 h，然后分别在160、180和200 ℃下烤制40min，制成苦荞全面包、苦荞芯面包和苦荞皮面包，冷冻干燥后将其在粉碎机中粉碎成粉末，在-4 ℃下保存备用。

1.3.2 体外模拟胃消化[11]

称取800 mg苦荞粉用100 mL 0.9% NaCl溶液溶解，加入0.5 mL 1 mol/L HCl溶液(此时混合液pH=1.5)，随后加入10 mL模拟胃液(160mg胃蛋白酶(1：3000)溶于生理盐水中，用盐水调pH=1.5)；胃酸对照组：用等体积的0.01mol/L HCl 代替胃蛋白酶消化液，pH=2；空白对照组：用等体积的生理盐水代替模拟胃液，将混合液放置37 ℃用锡箔纸包好避光，在厌氧条件下振荡培养2 h。各组于胃消化0、20、40、60、80、120 min取样，离心，测定上清液黄酮含量和抗氧化活性。

1.3.3 体外模拟肠消化[12]

向经过胃消化后的混合液中逐滴加入0.5 mol/L NaHCO3，调pH=7.5，随后加入20 mL模拟肠液(V(2 mg/mL的胰蛋白酶液)：V(12 mg/mL的胆酸盐)=12:6)，继续在37 ℃恒温振荡培养箱中避光持续消化2 h(厌氧条件)。各组于肠消化0、0.5、1、1.5、2 h取样，离心，测定上清液黄酮含量和抗氧化活性。

1.3.4 黄酮含量测定

1.3.4.1 提取液提取[13]

称取样品粉末 1.0 g放入 50 mL 锥形瓶中，加入30 mL 75% 的乙醇溶液，在40 ℃下超声提取40 min，放入离心管内，在4 000 r/min下离心15 min，取上清液，重复操作一次，合并上清液，定容到 50 mL，得游离态黄酮提取液，待测。向离心后的沉淀物中加入 2 mol/L NaOH 室温避光涡旋1 min，混匀后超声提取1 h，在氮气条件下，调pH至中性，再加入乙酸乙酯 20 mL振荡5 min，4 000 r/min离心 10 min，取上清液，重复操作3次，合并上清液，定容 50 mL，得结合态黄酮提取液，待测。

1.3.4.2 黄酮的测定[14-15]

标准曲线的测定：精确量取浓度 200 μg/mL芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，分别加入75%的乙醇溶液5、4.8、4.6、4.2、3.8、3.4、3 mL，然后加5% 亚硝酸钠 0.3 mL，摇匀，静置 6 min，再加10%硝酸铝 0.3 mL，摇匀，静置 6 min，加4%氢氧化钠 4.0 mL，用75%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置 12 min。于510 nm波长下测定吸光度，并以芦丁标准浓度值为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线。芦丁标准曲线方程为y= 0.007 1x+ 0.057 9(R2= 0.987 3)。

黄酮的测定采用NaNO2-Al(NO3)3络合法测定：1 mL样品溶液与300 μL 5% NaNO2溶液反应6 min，然后加入10% Al(NO3)3溶液300 μL再反应6 min后，加入2 mL 4% NaOH溶液后用蒸馏水定容至 5 mL，反应 15 min，510 nm处测其吸光值。以芦丁作为标准曲线，所有样品中的总黄酮含量表示为mg/100 g。

1.3.5 抗氧化活性的测定

1.3.5.1 ABTS测定[16]

将ABTS用蒸馏水配制成2 mmol/L溶液，取50 mL溶液与200 mL K2S2O8水溶液 (70 mmol/L)混合均匀，避光放置12～16 h，得ABTS+·溶液。用磷酸盐缓冲稀释其至吸光度为0.70±0.02(A734nm)。然后将0.5 mL的样品和2.5 mL的ABTS+·工作液混合均匀于30 ℃下孵育6 min，孵育结束后在30 ℃、745 nm条件下测定其吸光值A1。以在相同条件下，0.5 mL甲醇和2.5 mL 的ABTS+·工作液的混合溶液的吸光值A2为对照。每个样品对ABTS+·清除能力用公式进行计算：

1.3.5.2 清除羟自由基的测定[17]

取1.0 mL浓度为1.865 mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液于带塞试管中，分别加入浓度为0.2 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液2 mL和1 mL不同浓度的样品，充分混匀后加入1.0 mL浓度为1.865 mmol/L的FeSO4溶液，再次混匀后加入1.0 mL 0.03% H2O2，于37 ℃恒温水浴，60 min后，在536 nm下分别测量吸光度值得As，以蒸馏水代替样品作为空白组测吸光度值得Ab，以蒸馏水替代H2O2作为损伤组，测其吸光度值An，抗氧化剂的羟自由基清除率按公式计算：

1.3.6 数据统计分析

采用IBM SPSS V 20.0 软件分析实验数据，实验结果采用平均值±标准差的形式表示，进行差异显著性分析(P<0.05)和相关性分析。采用Origin 7.5软件作图进行拟合函数分析。实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 原料粉中的成分含量

表1 苦荞原料粉中的成分含量(干基)

苦荞麦的不同部位的营养成分含量不同，在苦荞皮粉中脂肪含量较高，苦荞芯粉中主要是淀粉含量较高。苦荞皮粉中游离黄酮和结合黄酮含量较高，因而不同苦荞粉经过加工后，营养价值不同，在人体的吸收也具有差异性。

2.2 黄酮类化合物的释放量分析

体外模拟胃消化过程中，苦荞面包中游离态黄酮和结合态黄酮释放量的变化情况如图1所示，与模拟胃消化0 h相比，苦荞全、芯、皮面包的游离态黄酮释放量在40 min内显著升高。模拟胃消化的2 h过程中，苦荞全、芯和皮面包的游离态黄酮最大释放量分别是胃消化0 h的1.282、1.297、1.417倍。这与王慧清等[24]在全麦粉模拟消化过程中的研究结果相一致。同时，在160、180和200 ℃下烤制的3种苦荞面包的黄酮类化合物的释放量的增长趋势相似。180 ℃烤制下的苦荞面包的黄酮含量虽然起始含量较高，但是在胃消化过程中的释放量增长率较低。黄酮类物质对热敏感，加热过程中可能会使结合态黄酮增多，使游离态黄酮的结构发生改变，这间接促使游离态黄酮的消化吸收率增加。黄酮释放量的增加可能是，苦荞面包在胃消化过程中会受到胃蛋白酶的作用，将与黄酮类物质结合的蛋白质水解成小分子多肽，从而使被蛋白质包裹的结合态黄酮分离释放出来。Crespy等[18]研究表明，在胃消化过程中，游离的黄酮糖苷能够在胃中吸收，而结合的黄酮糖苷则吸收较少。这可能是结合态黄酮在胃消化过程释放量比游离态黄酮少的原因。

体外模拟肠消化过程中苦荞面包的黄酮释放量变化情况如图2所示。与模拟肠消化0 h相比，苦荞面包的黄酮释放量在0.5 h后趋于稳定，其中结合态黄酮释放量的增长率为61.45%～194.55%，显著高于游离态黄酮的增长率28.98%～44.35%。这可能是由于苦荞中淀粉和蛋白质的含量较高，胰酶中的胰蛋白酶能够促使与结合黄酮相互作用的蛋白质上的羧基断裂，胰淀粉酶能够水解淀粉中的α-1,4糖苷键，从而促进了结合态黄酮的水解，使其释放量显著增加。

2.3 体外消化过程中苦荞面包的抗氧化活性分析

2.3.1 体外消化过程中ABTS的分析

苦荞全、芯、皮面包的在胃肠消化中ABTS+·清除率结果如图3所示。在胃消化阶段，苦荞面包的抗氧化能力随消化时间逐渐增加，与模拟胃消化0 h相比，苦荞面包的ABTS值在40 min后趋于稳定。苦荞全面包、芯面包和皮面包在胃消化阶段的ABTS最大增长率分别为14.94%、16.19%和13.27%。与模拟消化0 h相比，苦荞面包的ABTS值在0.5 h内显著增加。在肠消化的2 h内，苦荞全面包、芯面包和皮面包在180 ℃下释放量增加的最多。研究发现，苦荞面包在烤制180 ℃下呈现出来的抗氧化能力较强，但是在180 ℃下烤制苦荞面包的抗氧化能力，在消化中的增长率比160 ℃和200 ℃的低。由于黄酮类物质是天然的抗氧化剂，苦荞面包的抗氧化能力在体外消化过程中的变化趋势与黄酮类物质大致相似。黄酮类物质在消化中释放量显著增加，因此苦荞面包的ABTS值也随之显著增加。

2.3.2 ·OH清除能力

苦荞全面包、苦荞芯面包、苦荞皮面包的羟自由基清除能力测定的研究如图4所示。在胃消化阶段，苦荞面包的羟自由基清除能力在消化时间60 min之前增长较快，而在60 min后趋于稳定。3种苦荞面包在180 ℃下的·OH清除率比160、200 ℃的高，但是胃消化过程中的·OH清除率最大增长率分别为：苦荞全面包在200 ℃下为15.73%，苦荞芯面包在200 ℃下为16.20%，苦荞皮面包在160 ℃下为13.38%。由此表明，虽然180 ℃烤制下的苦荞面包原始抗氧化能力较强，但在胃消化过程中增长不明显。在肠消化阶段，0.5 h之前抗氧化活性增加，0.5 h后清除率趋于平稳。苦荞全面包、芯面包和皮面包在胃肠消化之后的·OH清除能力的变化趋势跟游离态黄酮类化合物的变化趋势相似。黄酮类化合物的存在形式，取代基的数量和位置等都会影响抗氧化能力。

2.4 苦荞面包体外消化过程中黄酮类物质释放量动力学分析

在模拟胃肠消化的过程中，发现黄酮类物质的释放量与消化时间存在显著的相关关系，对不同消化阶段，游离态黄酮和结合态黄酮的释放量，在不同的消化时间下进行函数拟合，能够更加直观的分析黄酮类物质随消化时间的变化趋势。通过对苦荞面包在胃肠消化过程中黄酮释放量的动力学变化分析，发现胃消化过程中游离态黄酮释放量随消化时间的变化趋势符合指数函数模型Y=aln(x)+b，胃消化过程中结合态黄酮的释放量随消化时间的变化趋势符合幂函数模型Y=aXb，胃消化阶段的黄酮类物质释放量的动力学参数见表2。而肠消化过程中黄酮释放量与消化时间的变化规律拟合度较低，R值均在0.85以下，苦荞面包在肠消化0.5 h后黄酮释放量均趋于稳定状态。由表2可知，苦荞三种面包的消化速率大致相似。由于苦荞中游离态黄酮和结合态黄酮的存在形式不同，与蛋白质、淀粉等基本营养成分的相互作用不同，从而使得在消化的起始阶段游离态黄酮释放量速率要高于结合态黄酮，但在消

表2 体外消化过程中酚类物质释放量变化动力学参数

化后期结合态黄酮释放量速率要高于游离态，可能是由于结合态黄酮需要在酶的作用下将与之结合的蛋白质分解成小分子才能够释放出来。

2.5 体外消化过程中黄酮类物质释放量与抗氧化活性相关性分析

苦荞面包中游离态黄酮和结合态黄酮与抗氧化活性的相关性分析见表3。黄酮类物质的释放量越高，其抗氧化活性也随之增加。但黄酮类物质的含量并不能够代表样品中化合物之间的协同和拮抗作用，相关关系数之间的差异，能够间接反映出消化过程中黄酮类物质的结构和含量发生了变化[22]。游离黄酮与ABTS+·和·OH清除能力具有正相关性，而结合黄酮与抗氧化能力的相关性较差。其中结合黄酮与ABTS+·清除能力不具有显著的线性关系。对小扁豆的抗氧化活性研究表明，消化液中的酚类物质与抗氧化活性有相关性，且不同抗氧化体系的相关程度不同[23]，与本研究结果具有相似性。

表3 黄酮含量与抗氧化性的相关性

注：*为显著影响，P<0.05； **为极显著影响，P<0.01。

3 结论

本实验通过体外模拟消化法，对不同温度下烤制的3种苦荞面包的黄酮含量及抗氧化活性进行了研究。结果表明：3种苦荞面包在胃肠消化过程中黄酮类物质的释放量均显著增加，同时胃消化过程中游离态黄酮释放量符合指数函数模型，结合态符合幂函数模型。在抗氧化活性测定中，胃肠消化过程中苦荞面包的ABTS+·清除率和·OH清除率都显著增加。同时，两者与黄酮类物质释放量呈现正相关性。在前期研究烤制对苦荞面包影响的时候发现，烤制温度在180 ℃时，苦荞中的黄酮类物质被极大程度的保留下来，但是在体外模拟消化过程中，在160 ℃烤制下的苦荞面包的黄酮释放量增长较高。由此可以推测，苦荞面包经过人体消化后抗氧化活性增加，还需进一步实验验证。