槐花黄酮磷脂复合物制备及其对植物油氧化稳定性的影响

蒋新龙 郭叶莹 吴小刚 陈品品 叶小霞 蒋益花

(浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015)

食用植物油中含有较多的不饱和脂肪酸，其中包括油酸(C18 ∶1)、亚油酸(C18 ∶2)以及亚麻酸(C18 ∶3)，在加工、储藏以及销售过程中极易出现氧化酸败现象。油脂发生氧化所生成的氧化物不仅影响其营养价值、口感、风味，且会对癌症等多种疾病产生诱发作用[1-2]。延缓油脂氧化酸败的一种有效方法是添加抗氧化剂[3-4]。

黄酮类化合物除具有通常的抗菌、抗癌、抗炎和抑制脂肪氧化酶等生物活性外[5-7]，还具有很强的抗氧化性，在油脂抗氧化方面有显著效果[8-10]。但黄酮含有多个极性基团，分子极性大，其亲水性较强，故在油中的溶解度和界面分散性能不是很好，因此大大抑制了黄酮在抗油脂氧化中的应用。有学者研究发现，黄酮与磷脂之间具有特殊的亲和力，通过制备磷脂复合物，可以提高黄酮的脂溶性[11]。本研究采用超声-微波协同技术，以槐花黄酮为原料制备黄酮磷脂复合物，利用正交设计对制备工艺条件进行优化，并初步探索黄酮磷脂复合物对植物油抗氧化的影响，旨在为槐花黄酮的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

槐花：50 ℃鼓风干燥72 h，粉碎过60目筛，备用；植物油为新鲜精炼核桃油和葡萄籽油；大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱98%)；芦丁；其他试剂均为分析纯。

CW-2000型超声-微波协同萃取/反应仪、D8017TL-2H型格兰仕微波炉、布鲁克TENSOR27 红外光谱仪、岛津UV2450紫外可见分光光度计、UV-1600型紫外可见光谱仪、FW100 型高速万能粉碎机、AB204-N 型分析天平。

1.2 实验方法

1.2.1 槐花黄酮的制备和含量测定

槐花黄酮的制备：本实验室采用微波辅助乙醇-磷酸氢二钾双水相的方法对槐花中黄酮进行提取，并用大孔树脂柱进行纯化。具体方法：以磷酸氢二钾质量浓度117 mg· mL-1、54%乙醇溶液组合的乙醇-磷酸氢二钾双水相萃取体系，液料比60 ∶1(V/m)、微波提取时间30 s、微波功率为648 W等条件下，得到上相；将上相减压浓缩得到的浓缩液调至pH值为6，过D-101大孔树脂柱，用75%乙醇溶液洗脱，得到洗脱液，再对洗脱液进行减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度高达90%的槐花黄酮，待用。

黄酮含量的测定：采用紫外分光光度法测定黄酮得率[12]，得到芦丁质量浓度C(mg· mL-1)与吸光度A之间的关系式为：A=28.289C+0.037 2，其线性范围为0.00～0.10 mg· mL-1，相关系数R2=0.994 7。待测样品同法在360 nm处测定吸光值，根据回归方程计算黄酮含量。

1.2.2 黄酮磷脂复合物制备实验

制备方法：取一定量黄酮，置于100 mL 仪器专用萃取瓶中，加入适量无水乙醇配成一定黄酮质量浓度，再按黄酮与磷脂的反应投料比加入磷脂，搅拌使样品良好分散于无水乙醇中。将萃取瓶放于仪器萃取炉腔中，安装好冷凝回流装置，分别设置微波功率、反应时间等参数，检查完毕后开启微波及超声(固定超声条件：超声输出功率50 W，频率40 kHz，开启超声)进行反应。反应一定时间后，减压除去无水乙醇，再加入少量的三氯甲烷溶解其中的磷脂及复合物，溶解后进行抽滤，滴加少量的三氯甲烷洗涤固体至只剩下未反应的黄酮，收集沉淀，干燥后称重W，同时滤液再次减压干燥，蒸干所得物即为黄酮磷脂复合物。黄酮的初始投料量与沉淀量的差值即为与磷脂复合的黄酮的量，从而计算黄酮与磷脂的复合率。

式中：W0为黄酮初始投入量;W为黄酮沉淀量。

单因素实验：按照1.2.2提取方法，固定初始条件其他量不变，采用控制变量法，考量黄酮质量浓度、投料比(磷脂与黄酮的质量比)、反应时间和微波功率等因素对复合率的影响。超声条件固定(超声输出功率50 W，频率40 kHz)，分别设置投料比梯度2 ∶1、1 ∶1、1 ∶1.5、1 ∶2、1 ∶2.5；黄酮质量浓度梯度1、2、3、4、5 mg/mL；反应时间梯度10、20、30、35、40 min；微波功率梯度100、200、300、400、500 W。

正交优化实验：在单因素试验的基础上，选择黄酮质量浓度、反应时间、微波功率、投料比4个因素为主要变量，以复合率为指标，采用 L9(43)进行正交试验。

1.2.3 黄酮磷脂复合物的理化性质实验

紫外分析：将一定量的黄酮以及黄酮磷脂复合物分别溶于无水乙醇溶液中，制成一定浓度的乙醇溶液；同样方法制备一定浓度的磷脂乙醇溶液，将3种溶液进行紫外全波长扫描。

红外分析：采用KBr压片法分别对黄酮、磷脂及黄酮磷脂复合物在400～4 000 cm-1范围内进行红外扫描。

溶解度的测定：取20 mL溶剂(水、正辛醇)，分别加入过量的黄酮或黄酮磷脂复合物于室温下搅拌6 h，取上清液过0.45 μm滤膜，测定其上清液浓度。

1.2.4 黄酮磷脂复合物对植物油抗氧化影响实验

1.2.4.1 黄酮磷脂复合物植物油样品液的制备

参照 GB 2760—2014中一般在植物油脂中加入天然抗氧化剂用量，本实验黄酮磷脂复合物浓度梯度设置为 0.01%～0.06%。按设计所需的质量分数将适量的黄酮磷脂复合物添加到植物油中，先超声辅助溶解10 min，再磁力搅拌10 min，使黄酮磷脂复合物与植物油充分混匀，得到系列黄酮磷脂复合物植物油样。

用所得到的系列黄酮磷脂复合物植物油样，以油脂的过氧化值为衡量指标[13]，采用GB/T 5538—2005法测定过氧化值，先测定常温下POV值，再测定98 ℃加热 6 h 后POV值，根据加热后过氧化值的相对大小，确定最佳添加量。

1.2.4.2 植物油表观活化能测定

采用Schaal烘箱法[14]测定样品POV随贮藏温度、时间的变化。将最佳黄酮磷脂复合物添加量的植物油置于碘量瓶中密封，分别置于45、55、65 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中。每隔2 d(共10 d)取样，测定样品POV0。

植物油的氧化符合一阶动力学反应[15,16]，在植物油中添加抗氧化剂后植物油的氧化也符合一阶动力学反应[17]。本研究在根据一级反应动力学方程ln(POV/POV0)=-kt，对不同时间t的POV进行拟合，得到回归方程和相关系数，求得反应速率常数k。根据Arrhenius反应速率k与温度T的关系经验公式(lnk=lnk0-Ea/RT)，用lnk对1/T作图，可得到一条斜率为-Ea/R的直线，由斜率可得表观活化能Ea[18]。同法空白参照。

1.3 统计方法及分析软件

以上指标均重复测定3次并取平均值，应用SPSS20.0软件进行数据统计，利用Ori gin8软件作图，用Duncan多重比较(SSR法)检验各处理平均数之间的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 黄酮磷脂复合物制备

2.1.1 单因素实验

根据张胜海[19]、石森林[20]等研究结果和本团队的预试结果，确定无水乙醇为反应溶剂。

图1可知，在磷脂 ∶槐花黄酮质量比为2 ∶1时，磷脂复合物的复合率最高。投料比对复合率有较大的影响，复合率随体系中磷脂比例的增加而增加。当磷脂 ∶槐花黄酮质量比为2 ∶1时，二者的相互作用最充分。

在反应物浓度为1～2 mg/mL时，磷脂复合物的复合率随着黄酮浓度的增大而增大，当反应物浓度为2 mg/mL时，磷脂复合物的复合率最高。黄酮浓度对复合率有较大影响，黄酮浓度较小时，复合率较高。因为黄酮在溶液中须经碰撞才能发生反应，较高的浓度反而不利于反应的进行[21]。

在反应时间为10～35 min时，磷脂复合物的复合率逐渐增大，当反应35 min时，磷脂复合物的复合率最高。反应时间过长，微波的热效应会使黄酮产生降解。

在微波功率为300 W时，磷脂复合物的复合率达到最大值。超声-微波协同技术的最的优势在于能同时充分利用微波的高能作用和热效应以及超声波的空化作用。随着微波功率的增加，磷脂分子和黄酮的热力学活动趋于活跃，有利于两者之间的进一步结合。但微波功率过高，高能热效应明显，黄酮稳定性较差，不利于黄酮磷脂复合物的形成。且温度过高也不利于磷脂复合物的稳定。

图1 黄酮磷脂复合物制备条件单因素实验结果

2.1.2 正交实验结果及分析

表1为正交试验的因子与水平。正交实验结果见表2。

表1 4因子在3水平正交试验的因子与水平

表2 正交实验设计及结果

表3 方差分析表

注：因素D影响小，故作为方差分析的误差处理；F0.05(2、2)=19.00，“*”表示因素影响显著。

表2中k1、k2、k3表示每个因素所进行3次实验所得的复合率的平均值。R为平均数的极差，R越大表明变化幅度大，说明该因素的水平变化对复合率的影响越大，该因素即是最大影响因素。由表2极差可以看出影响复合率的因素主次依次排列为：黄酮质量浓度(A)>投料比(B)>反应时间(C)>微波功率(D)。由表3可以看出，对复合率的影响主次依次排列为：黄酮质量浓度(A)>投料比(B)>反应时间(C)>微波功率(D)。方差分析和极差分析在复合率影响主次排列上完全一致。表3还可以看出，对复合率的影响黄酮质量浓度(A)和投料比(B)显著，其他则不显著。直观分析，实验的最优水平组合为A2B2C3D1；根据每个因素k1、k2、k3实验的最优水平组合为A2B2C3D2。因为反应时间40 min与35 min、30 min差异显著，微波功率三个水平之间无显著差异，综合分析提取成本和复合率，确定最佳工艺条件A2B2C3D1，即黄酮质量浓度2 mg/ mL，投料比1 ∶2 g/g，反应时间40 min，微波功率200 W。根据最佳工艺条件进行工艺验证实验，复合率为79.98%，与预测值无显著差异。

2.2 理化性质实验

2.2.1 光谱分析

紫外扫描如图2所示。黄酮在 265、370 nm处有强烈吸收峰，这是由于黄酮具有共轭不饱和结构所致；卵磷脂没有共轭结构，以致卵磷脂只有在215 nm处有紫外最大吸收峰出现；黄酮-卵磷脂复合物与黄酮在紫外图谱中没有显著差异，且它们均在 265、370 nm处有强烈吸收峰，与黄酮一致。由此可知，黄酮与卵磷脂在形成复合物的过程中没有产生新的共轭结构，它们仅仅是通过非共价结合。

图2 紫外吸收光谱图

图3 红外吸收光谱图

由图3可以知道，在黄酮的红外图谱中，约3 417 cm-1处代表的是羟基特征峰，随后分别是羰基(1 647 cm-1)和苯环(1 516、1 286、1 196、1 132 cm-1)的特征吸收峰。黄酮和卵磷脂的复合物与黄酮的吸收光谱大致相同，黄酮和卵磷脂的特征吸收峰都可以在复合物的吸收光谱中找到，复合物的吸收光谱表现为黄酮和卵磷脂的吸收光谱的叠加。但黄酮在1 000～1 500 cm-1之间的大部分特征吸收特征峰变化比较大，表明黄酮和卵磷脂不是简单的一种混合状态，黄酮与卵磷脂发生了相互作用，但复合物在扫描范围内是没有出现新的吸收峰。由此说明，黄酮和卵磷脂在形成复合物的过程中并没有形成新的共价键，黄酮和卵磷脂在复合物中仍然各自保留其基本的化学结构。

由红外、紫外光谱分析初步看出在复合物中并无新的化学键生成。黄酮与磷脂的复合是一种弱的相互作用[21]，从结构上看，黄酮酚羟基上的氧具有负电性，磷脂带有正电性的季胺氮，两者可产生偶极-偶极作用力而使两分子结合[22]，形成黄酮磷脂复合物。

2.2.2 溶解度测定结果

槐花黄酮是极性化合物，在油脂中的溶解性极低，而其与磷脂形成的包合物后在油脂中的溶解性可以得到提高。实验结果表明，黄酮在 25 ℃正辛醇中的溶解度为 0.877 1 mg/mL；而黄酮卵磷脂复合物在正辛醇中的溶解度增加至5.582 7mg/mL，脂溶性增加了6.4倍，脂溶性得到显著提高，可能是复合物中磷脂的极性基团与黄酮相互作用而受到一定的掩蔽，使得复合物表现出较强的脂溶性[23]。黄酮在 25 ℃水中的溶解度为 0.026 9 mg/mL；而黄酮卵磷脂复合物在水中的溶解度增加至0.513 3 mg/mL，水溶性增加了19.1倍，水溶性也得到了很大改善，可能是由于其在水中形成的类似脂质体的胶团结构的增溶作用[21]。实验结果表明，磷脂复合物可改善黄酮的溶解性能。

图4 槐花黄酮抗油脂氧化效果

2.3 槐花黄酮磷脂复合物对油样的抗氧化效果

2.3.1 浓度对槐花黄酮磷脂复合物抗油脂氧化效果的影响

由图4可知，添加槐花黄酮磷脂复合物后，葡萄籽油和核桃油的过氧化值均低于空白对照，说槐花黄酮磷脂复合物对葡萄籽油和核桃油具有抗氧化作用，且随着其添加量的增加，植物油的过氧化值逐渐降低，抗氧化活性增强，对葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有剂量效应的关系。

表4 植物油过氧化值的回归方程及活化能参数

注：y为ln(POV /POV0)；x为t。

2.3.2 温度对槐花黄酮磷脂复合物抗油脂氧化效果的影响

本研究采用抗油脂氧化效果最好的0.06%槐花黄酮磷脂复合物进行Schaal烘箱加速氧化实验。图5为两种植物油抗氧化稳定性在不同温度、时间下的变化。由图5可知，在45、55、65 ℃时，添加槐花黄酮磷脂复合物前后对葡萄籽油和核桃油的过氧化值变化趋势大体相同。随着温度升高和加热时间的延长，植物油的过氧化值逐渐升高，氧化速度加快。

图5 植物油抗氧化稳定性在不同温度、时间下的变化

根据1.2.3.2方法得到过氧化值的回归方程。由表4可知，植物油的氧化反应属于一级反应，其回归系数R>0.97，拟合度高，与周婵玉等研究结果一致[17]。且随着温度升高，氧化速率增大。

根据1.2.3.2方法得到表观活化能。表4可知，添加槐花黄酮磷脂复合物后植物油的活化能明显升高，说明添加槐花黄酮磷脂复合物的植物油的氧化反应较难进行。由于槐花黄磷脂复合物所含的酚类结构，可提供氢原子，使自由基转化为稳态的化合物，进而中断自由基反应[24]，提高了相应植物油的抗氧化性。

表4同样表明，核桃油表观活化能增大百分率比葡萄籽油大，说明槐花黄酮磷脂复合物对核桃油的抗油脂氧化效果更有效，主要原因是跟核桃油与葡萄籽油含有不同的脂肪酸成分有关[25]。核桃油比葡萄籽油亚麻酸含量高，多不饱和脂肪酸含量比葡萄籽油高。有试验表明，亚麻酸含量对油脂氧化影响远大于亚油酸含量的影响，且亚麻酸氧化速度为亚油酸的两倍[26]，含多不饱和脂肪酸油脂的氧化敏感性较高[25]。所以槐花黄酮磷脂复合物对核桃油的抗油脂氧化效果比葡萄籽油更有效。

3 结论

以槐花黄酮为原料，以复合率为衡量指标，采用超声-微波协同技术制备黄酮磷脂复合物，利用正交设计对制备工艺条件进行优化。最佳制备工艺为：无水乙醇为反应溶剂，磷脂与黄酮的投料比1 ∶2 g/g，黄酮质量浓度2 mg/mL，微波功率200 W，反应时间40 min，此制备条件下，黄酮磷脂复合物复合率为79.98%。

红外光谱和紫外光谱分析表明，黄酮与卵磷脂在形成复合物的过程中没有产生新的共轭结构，它们仅仅是通过非共价结合。磷脂复合物可改善黄酮的溶解性能，水溶性增加了19.1倍，脂溶性增加了6.4倍。

抗氧化实验结果表明，槐花黄酮磷脂复合物对葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有剂量效应的关系。在植物油中添加黄酮磷脂复合物后植物油的氧化符合一阶动力学反应。添加黄酮磷脂复合物后植物油的氧化反应活化能较大，添加黄酮磷脂复合物可以延缓葡萄籽油和核桃油的氧化反应。核桃油表观活化能增大百分率比葡萄籽油大，槐花黄酮磷脂复合物对核桃油的抗油脂氧化效果更好。本研究为槐花黄酮的进一步资源化开发利用提供了一定的技术支撑。