N，N-二甲基甲酰胺通过激活Nrf2信号通路减轻顺铂引起急性脏损伤的研究

文丽波

【摘  要】N，N-二甲基甲酰胺（DMF）具有抗炎和抗氧化的能力。我们旨在探讨DMF是否可以通过NF-E2相关因子2（Nrf2）途径调节顺铂诱导的大鼠肾脏损伤。

【关键词】N，N-二甲基甲酰胺;Nrf2信号通路;急性肾损伤

【中图分类号】R459.7      【文献标识码】A      【文章编号】1004-7484（2020）09-0096-01

顺铂是广泛的高效抗肿瘤药物。但是，顺铂的肾毒性也会在治疗过程中引起急性肾损伤（AKI）。因此，减轻顺铂引起的肾毒性的研究已得到充分研究^【1】。近年来，NF-E2相关因子2（Nrf2）在调节氧化应激中的作用引起了广泛关注。Nrf2是细胞防御氧化应激的重要核转录因子。已经证实，Nrf215-18可调节200多种内源保护性基因。

N，N-二甲基甲酰胺对由毒物和缺血引起的器官损伤的发生和发展的影响已得到公认。

动物

将共30只体重180-220g的SD大鼠饲养在温度可控制的房间中，该房间可自由获取食物和水。对照组大鼠灌胃蒸馏水（0.01mL/g）10天。DDP组的大鼠用蒸馏水（0.01mL/g）注射7天，然后在第7天注射顺铂（25mg/kg）。之后，将大鼠继续用蒸馏水再给药3天。DMF组的大鼠在头7天用等剂量蒸馏水处理。

顺铂治疗后，再给予DMF 3天。最后一次给药后一小时，从眼眶静脉取血，麻醉后处死大鼠。观察并记录在整个给药期间大鼠的体重和日常活动的变化。

肾功能评估

每次在胃内给药之前记录大鼠的体重。处死大鼠后，立即收获新鲜的双侧肾脏组织并称重。肾脏指数=肾脏重量/体重。将总共2 mL血液样品以3500 g/min的速度离心30分钟。用肌氨酸氧化酶法测定血清肌酐（Cr）水平，用脲酶法测定尿素氮（BUN）水平。

组织学检查

将每组的肾组织切成冠状切片，用10%甲醛固定并包埋石蜡。然后将组织用苏木精和曙红染色。通过半定量检查肾小管坏死评估组织学变化。评估标准如下：0=无损坏，1=10%，2=11%至25%，3=26%至45%，4=46%至75%，5=>76%。观察到每个样品的五个随机选择的区域。

TUNEL分析

根据原位DNA末端转移酶（TUNEL）测定法（ApopTag加过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒;Chemicon，Millipore，Billerica，MA，USA）检测肾脏切片中的细胞凋亡。5微米厚的石蜡切片用于TUNEL染色，并用甲基绿复染。在高倍显微镜下计数10个随机视野中TUNEL阳性细胞的数量。

生化测量

在肾脏组织的颜色从红色变为白色后，将肾脏迅速移出并置于液氮中。将部分组织搅匀并储存在-80°C的冰箱中。根据相应检测试剂盒的说明书测量MDA，T-AOC，CAT，GSH，SOD和ROS的含量。

免疫组织化学染色

将石蜡包埋的组织脱蜡并水合后，添加50μL抗大鼠PCNA（1：100）并在室温下孵育1小时。用PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤3次后，加入40-50μL相应的二抗并在室温下再孵育1小时。加入二氨基联苯胺（DAB）（R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国），使颜色显影5-10分钟。用去离子水冲洗残留的DAB。最后将组织脱水，密封并在显微镜下观察。

蛋白质印迹

向肾脏组织中添加裂解缓冲液，并在冰上振摇30分钟。在4℃下以14，000g/min离心15分钟后，分离总蛋白。通过二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定试剂盒（Pierce，Rockford，IL，USA）计算蛋白质浓度。提取的蛋白质在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶中分离，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国马萨诸塞州Billerica的Millipore）。根据标准程序进行蛋白质印迹分析。一抗是Nrf2，血红素加氧酶-1（HO-1），NAD（P）H，奎宁氧化还原酶1（NQO-1）。二抗是抗小鼠和抗兔抗体。

统计分析

t检验用于比较连续变量。分类变量使用x2检验或Fisher精确概率方法进行分析。进行Kaplan-Meier法评估患者的生存时间，采用Log-rank检验比较不同曲线之间的差异。SPSS 22.0（统计产品和服务解决方案）用于数据分析（IBM，Armonk，NY，美国）。数据表示为平均值±标准偏差（x[–]±s）。p<0.05被认为具有统计学意义。

结果

DMF预处理改善了顺铂诱导的肾损伤小鼠的肾功能。

DDP组的体重和肾脏指数显着低于对照组（p<0.05），表明成功建立了顺铂诱导的大鼠肾脏损伤模型。与DDP组相比，用20 mg/kg DMF治疗后大鼠体重和肾脏指数显着改善（p<0.05）。此外，肾脏功能相关指标的定量分析显示，DDP组和DMF组的血清Cr和BUN含量高于对照组（p<0.05）。然而，DMF组的BUN和Cr水平仍显着高于对照组。

DMF保留肾脏组织学结构并减轻中性粒细胞浸润

对照组肾脏组织显微结构正常。DDP组观察到管状小管腔增大和扁平上皮。此外DDP组的肾脏组织中出现了颗粒变性和核固缩症的紊乱细胞。DDP组也有明显的肾小球收缩，间质增生和炎性细胞浸润。DMF组的肾脏损伤小于DDP组。DDP组和DMF组的肾小管损伤评分均高于对照组（p<0.05）。

DMF减少顺铂诱导的肾损伤后肾小管细胞凋亡和增强的细胞殖。

DDP组肾脏的TUNEL阳性细胞数量高于假手术组（p<0.05，）。但是，与DDP组相比，DMF组肾脏的TUNEL阳性细胞明显减少（p<0.05）。此外，我们对肾脏切片进行了PCNA免疫染色，以评估DMF是否会影响肾小管上皮细胞的增殖。DMF组的PCNA阳性细胞数量显着高于DDP组（p<0.05）。

DMF通过增强抗氧化能力降低了ROS的产生和组织损伤

我们的数据表明，DDP可以显著损害肾脏组织的抗氧化能力并刺激ROS的产生。施用DMF可有效恢复肾脏损伤组织匀浆（包括SOD，GSH，SOD，CAT和T-AOC）中抗氧化剂标记物的水平。DMF还减少了肾脏组織中的ROS生成。此外，DMF组肾脏组织中脂质过氧化指数MDA也显着低于DDP组。

为了探索DMF在顺铂引起的肾脏损伤中的保护机制，我们进一步从肾脏组织中提取了总蛋白。与对照组和DDP组相比，DMF组的Nrf2表达显著增加。

蛋白印迹结果还表明，与对照组和DDP组相比，DMF组中Nrf2的核转录显著增强。Nrf2核转录增强也增加了DMF组中HO-1和NQO-1的水平。

参考文献

[1]Manohar S，Leung N.Cisplatin nephrotoxicity：a re-view of the literature.J Nephrol 2018;31：15-25.

依托课题：

齐齐哈尔市科学技术局指令项目（SFGG-201902）

齐齐哈尔市科学技术局指令项目（SFGG-201410）