脑红蛋白在癫痫中的神经保护作用及其机制研究进展

杜欢 弥曼 郭向阳 刘曼玲 刘娜

[摘要] 本文回顾并讨论脑红蛋白的生物学功能以及其在癫痫中的神经保护作用及具体机制。脑红蛋白主要参与神经干细胞的增殖、促进轴突再生并减轻氧化应激水平、调控细胞凋亡及自噬途径，从而缓解神经元的急性损伤。在癫痫中发挥神经保护的具体机制：调节Pik3k/Akt信号通路、Jak2/Stat3途径以及抑制caspase-3活性，与促红细胞生成素受体协调共同启动有关信号转导途径。本文为预防癫痫引起的神经元细胞死亡和治疗癫痫引起的脑损伤提供了新思路。

[关键词] 脑红蛋白;神经保护;癫痫;脑损伤

[中图分类号] R742.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）10（a）-0067-04

Updates on neuroprotective effects and mechanisms of neuroglobin in epilepsy

DU Huan1   MI Man2   GUO Xiangyang3   LIU Manling2   LIU Na3

1.Graduate School， Xi′an Medical University， Shaanxi Province， Xi′an   710021， China; 2.Institute of General Medicine， Xi′an Medical University， Shaanxi Province， Xi′an   710021， China; 3.Department of Pediatrics， Shaanxi Provincial People′s Hospital， Shaanxi Province， Xi′an   710068， China

[Abstract] This study reviews and discusses the biological functions of neuroglobin and the neuroprotective effects of neuroglobin in epilepsy and its specific mechanisms. Neuroglobin is mainly involved in the proliferation of neural stem cells， promoting axonal regeneration and reducing oxidative stress levels， regulating apoptosis and autophagy pathways， thereby alleviating acute neuronal damage. The specific mechanism of neuroprotection of neuroglobin in epilepsy is regulating the Pik3k/Akt signaling pathway， the Jak2/Stat3 pathway， and the inhibition of activation of caspase-3 activity， and cooperating with the erythropoietin receptor to initiate the relevant signal transduction pathway. This review provides new ideas for preventing the death of neuronal cells caused by epilepsy and reference for treating brain damage caused by epilepsy.

[Key words] Neuroglobin; Neuroprotective; Epilepsy; Brain damage

2000年，在人类和老鼠大脑中主要表达的globin类型被识别，并称為脑红蛋白（Ngb）[1]。人类Ngb位于14号染色体的长臂上，位置为q24.3[2]。Ngb具有单核苷酸多态性，能产生蛋白质变异，可能影响正常功能，这表现在多种神经疾病中[3]。人类的Ngb是3-甲基-3α螺旋状蛋白质[4]广泛分布于大脑皮质、海马、丘脑、嗅球、下丘脑和小脑等代谢活跃的脑组织中，尤其在下丘脑中高度表达[5]。主要存在神经元细胞质中，也存在线粒体中[6]。Ngb是一种潜在对抗脑缺血缺氧的保护性蛋白质[7]。在缺血缺氧条件下，内源性Ngb表达量上升，有更高与O2结合的亲和力，释放O2清除氧自由基和活性氮，可作为神经保护剂减轻脑损伤[8-9]。然而，Ngb释放到缺血组织的氧气量可能会受到Ngb内在化学物质的影响。

1 Ngb的生物学作用

1.1 Ngb参与神经干细胞的增殖

Luyckx等[10]比较了敲除脑红蛋白基因（NgbKO）与通过LoxP引入Ngb基因（Ngbf1）两组中神经干细胞体外生长和增殖能力，结果NgbKO组神经干细胞体外生长和增殖能力更具潜力。同时，NgbKO组中Cdkn1a下调和Cdk6上调，能够增强细胞周期和增殖潜能并协同促进细胞周期的进展。Ngb丢失会影响多个细胞信号通路，最重要的可能是Akt-Tp53轴，具体分子机制还需进一步研究[10]。

1.2 Ngb促进轴突再生

脑缺血会导致严重的细胞死亡或损伤，包括轴突破裂或大脑收缩。轴突再生对于缺血再灌注后受伤的神经元或大脑功能恢复是至关重要的。Ngb在缺血再灌注中可作为轴突再生的驱动因素。Xiong等[11]研究证实Ngb促进轴突再生是通过激活p38 MAPK信号通路。Ngb主要通过7-122 aa片段和氧结合位点H64结合，激活p38，导致轴突再生。在缺血再灌注条件下，Ngb-p38信号传导被选择性激活，上调轴突生长关键蛋白，如GAP43、Tau-1、和NF200，诱导轴突再生。

1.3 Ngb是大脑中的协调神经保护器

Ngb可以使缺血后脑梗死体积的显著减少，促进脊髓损伤后的脊髓功能恢复[12]。然而，梗死面积大小以及血脑屏障对Ngb的不渗透性限制在脑损伤中应用。重组人类红细胞素（rhEPO）最近被证明在中枢神经系统中产生，能够显著减少凋亡细胞数量和脑水肿发生，保护受损的大脑。Zhu等[13]研究新生儿大鼠脑室周围白质损伤模型中发现促红细胞生成素受体（EPOR）和Ngb的水平均上调。EPOR呈现出急剧上升和缓慢下降的趋势，而Ngb的表达呈现出先持续上升后急剧下降的特点。这与Gao等[14]实验结果相似。Ngb和EPOR可能是脑梗死后重要的协同神经保护因子。当EPO与EPOR结合时，导致受体二聚化和磷酸化，增加Ngb表达相关多个信号转导途径的启动。因此，Ngb和EPOR是大脑中重要的协调神经保护器，但是二者间相互作用机制需要进一步研究。

2 Ngb在癫痫中的神经保护作用

2.1 Ngb在癫痫发作中的神经保护作用

癫痫是神经系统中较为常见的发作性疾病。癫痫发作引起神经冲动爆发，全身肌肉不自主抽搐，对氧的需求大大增加，造成脑组织神经元细胞相对缺氧，与心肌、骨骼肌收缩时造成短暂缺血类似。而Ngb作为氧的载体，在缺氧情况下表达上调[15]。随着癫痫的进展，海马区Ngb表达水平均上调;CA1、DG区的表达在24 h达到顶峰后，轻度下降，但持续处于高表达状态;CA3区却呈持续升高趋势。Ngb表达水平与海马神经元存活数呈正相关，提示Ngb可能是癫痫发作所致缺血缺氧的一种神经保护代偿机制[16]。惊厥发作时，Ngb表达随着发作持续时间延长而呈持续升高状态。而发作结束后Ngb表达随之下降，下降速度小于发作时上升速度，储备氧缓慢释放。这与高压氧作用相似，进而缓解因癫痫发作而产生的相对缺氧状态对神经元造成的急性损伤。虽然表达增加并不能直接抑制脑组织的异常兴奋点或是阻断癫痫异常放电通路，但Ngb作为神经系统特异性氧载体，发挥内源性神经保护作用、减轻癫痫发作，尤其是癫痫持续状态对脑组织造成的缺氧性损害[17]。癫痫发作时会引起细胞自噬和凋亡[18]。Rami等[19]证实在癫痫发作后，大脑皮层的神经元数量减少，凋亡细胞的数量增加。另外LC3、P62、Beclin-1和Bcl-2自噬及凋亡因子水平的变化显示，在自噬及凋亡发生的癫痫大鼠大脑发育过程中，如LC3表达增强可能是由溶酶体活性降低或自噬体-溶酶体融合改变引起。癫痫发作会引发与自噬损伤相关的病理改变。反之，在前馈回路中能够引发更多的癫痫发作，导致更高的癫痫发作频率和症状反复发生[20-21]。Ngb能够调控自噬途径，减轻癫痫中神经元细胞的死亡。然而，具体机制尚未明确，可能会成为未来研究的新方向。

Ngb能够减轻氧化应激水平、调控细胞凋亡及自噬途径。目前已有证据表明，自噬和癫痫发生之间有直接关系。如果能发现一种可穿过血脑屏障并上调Ngb表达的小分子物质，将会使癫痫发作或癫痫发作后导致脑损伤的患者获益。银纳米颗粒（AgNPs）是直径在1～100 nm之间的银原子簇。在评价AgNP暴露对大鼠皮质、海马和小脑Ngb表达水平的结果中显示，海马区AgNP对Ngb表达水平无调节作用。而在小脑中能否增加Ngb的表达[22]，还需更深一步研究证实。

2.2 Ngb在癫痫引起的脑损伤的神经保护作用

在癫痫引起的脑损伤中，星形胶质细胞可以合成并释放Ngb，有抗氧化、抗凋亡作用，代表了一种内源性神经保护机制[23]。Ngb有独特的生理功能，与其他球蛋白（血红蛋白、肌红蛋白）氧气储存和运输作用不同[24]。Ngb作为一种代谢调节剂，抑制AMPK信号通路传导来增强细胞合成代谢，表现为增加糖原和脂肪生成[25]。Ngb在大脑发育的祖细胞群中有所表达，在脑损伤造成缺血时表达增加，可能与缺血性神经保护和神经发生的作用机制相似[26]。另外，在脑损伤后，星形胶质细胞中Ngb表达增加，促进神经元存活。张蓓等[27]证实Ngb对局灶性脑缺血大鼠有神经保护作用可减小脑梗死体积，改善神经功能。

3 Ngb在癫痫中的神经保护机制

3.1 Ngb通过pi3k/akt信号对癫痫形成的缺血性脑损伤进行神经保护

在癫痫形成脑缺血后，Ngb通过pi3k/akt信号通路，对神经细胞起到了保护作用，这条信号通路与细胞存活有关。血红素不但上调了mRNA和蛋白质的表达，也增加了pAkt水平。逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹分析显示，抑制pi3k/akt对mRNA和蛋白质的表达没有影响，而对Ngb表达有影响，提示Pi3k/Akt在Ngb神经保护有关信号通路的中下游[28]。

3.2 Ngb减弱了通过Jak2/Stat3途径获得的氧葡萄糖剥夺引起的细胞凋亡

癫痫发作可引起大脑的氧葡萄糖剥夺，许多机制显示了Ngb对氧葡萄糖剥夺（OGD）的神经保护作用。Ngb通过调控某些基因的表达来保护神经系统。此外，Ngb可以抑制线粒体的凋亡，通过Jak2/Stat3信号途径促进了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并阻断caspase-3激活从而抑制细胞凋亡。研究结果显示，通过激活Jak2/Stat3途径，Ngb可以保护神经细胞免受OGD诱导的细胞凋亡。

3.3 Ngb抑制caspase-3活性，对星型胶质细胞起到保护作用

Ngb可以促进神经元的生长。对于星型胶质细胞的保护作用，主要通过恢复内源性抗氧化酶的表达和活性，减少活性氧（ROS）产生和促炎细胞因子[诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2、白细胞介素（IL）-6、IL-33表达体现。Ngb作为一种胶质保护剂，通过调节线粒体呼吸频率等功能抑制H2O2激活caspase-3，防止H2O2诱导氧化应激和星形胶質细胞凋亡[29]。

4 结语

Ngb在癫痫造成的脑缺血缺氧下有一定的神经保护作用，包括参与神经干细胞增殖，促进轴突再生。目前发现的机制有以下3种：Pi3k/Akt信号通路抑制线粒体凋亡;Jak2/Stat3信号途径促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，阻断caspase-3激活，抑制细胞凋亡;抑制磷酸肌酸-3激酶，恢复内源性抗氧化酶表达和活性，减少ROS产生和促炎细胞因子表达。然而，具体机制尚未明确，需要进一步研究证实。Ngb能够缓解癫痫发作引起的神经元急性损伤，可能与癫痫发作时引起细胞自噬和凋亡有关。Ngb减轻氧化应激水平、调控细胞凋亡及自噬途径。另外，da Concei？觭？觔o等[22]发现银纳米颗粒能增加小脑中Ngb的表达。基于此研究，如果设计或发现一种新的引物，能够穿过血脑屏障并上调或启动Ngb表达，可能会对癫痫发作或癫痫发作后导致脑损伤的患者获益，这将成为治疗惊厥或癫痫发作性疾病的一种新方法。

[參考文献]

[1]  Burmester T，Weich B，Reinhardt S，et al. A vertebrate globin expressed in the brain [J]. Nature，2000，407（6803）：520-523.

[2]  Lifton RP，Goldberg ML，Karp RW，et al. The Organization of the Histone Genes in Drosophila melanogaster： Functional and Evolutionary Implications [J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1978，42（2）：1047-1051.

[3]  Yi L，Ling F，Xue XH，et al. Association between Ngb polymorphisms and ischemic stroke in the Southern Chinese Han population [J]. BMC Med Genet，2008，9（1）：110-120.

[4]  Ascenzi P，di Masi A，Leboffe L，et al. Neuroglobin：From structure to function in health and disease [J]. Mol Aspects Med，2016，52：1-48.

[5]  Cutrupi S，Ferrero G，Reineri S，et al. Genomic lens on neuroglobin transcription [J]. Iubmb Life，2014，66（1）：46-51.

[6]  Elke F，Liesbet T，Wim M，et al. Neuroglobin and cytoglobin overexpression protects human SH-SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death [J]. Neurosci Lett，2006，410（2）：146-151.

[7]  Lin Y，Cai B，Xue XH，et al. TAT-mediated delivery of neuroglobin attenuates apoptosis induced by oxygen-glucose deprivation via the Jak2/Stat3 pathway in vitro [J]. Neurol Res，2015，37（6）：531-538.

[8]  李直.乏氧应激与小鼠中枢神经系统脑红蛋白的表达[D].开封：河南大学，2017，6：1-50.

[9]  Herold S，Fago A，Weber R E，et al. Reactivity studies of the Fe（Ⅲ）and Fe（Ⅱ）NO forms of human neuroglobin reveal a potential role against oxidative stress [J]. J Biol Chem，2004，279（22）：22841-22847.

[10]  Luyckx E，Van LW，Andre D，et al. Loss of neuroglobin-expression alters Cdkn1a/Cdk6-expression resulting in increased proliferation of neural stem cells [J]. Stem Cells Dev，2018，27（6）：378-390.

[11]  Xiong XX，Pan F，Chen RQ，et al. Neuroglobin boosts axon regeneration during ischemic reperfusion via p38 binding and activation depending on oxygen signal [J]. Cell Death Dis，2018，9（2）：163-179.

[12]  高海浩，尚爱加，陶本章，等.氯化血红素诱导脊髓组织脑红蛋白高表达对脊髓损伤大鼠运动功能的保护作用[J].解放军医学院学报，2019，40（1）：58-61，67.

[13]  Zhu L，Huang L，Wen Q，et al. Recombinant human erythropoietin offers neuroprotection through inducing endogenous erythropoietin receptor and neuroglobin in a neonatal rat model of periventricular white matter damage [J]. Neurosci Lett，2017，650：12-17.

[14]  Gao Y，Mengana Y，Cruz YR，et al. Different Expression Patterns of Ngb and EPOR in the Cerebral Cortex and Hippocampus Revealed Distinctive Therapeutic Effects of Intranasal Delivery of Neuro-EPO for Ischemic Insults to the Gerbil Brain [J]. J Histochem Cytochem，2011，59（2）：214-227.

[15]  蔡瀚培，郑树法，康德智.脑红蛋白在中枢神经系统损伤中的保护作用研究进展[J].中华神经医学杂志，2018， 17（8）：847-850.

[16]  张菲菲，程艳伟，于敏敏，等.大鼠癫痫持续状态后海马组织各区脑红蛋白表达的实验研究[J].癫痫杂志，2017， 3（3）：217-222.

[17]  刘广韬，潘隆盛，尚爱加，等.惊厥发作不同时相下脑红蛋白表达的初步研究[J].山西医科大学学报，2013，44（4）：249-252，323.

[18]  Dingledine R，Varvel NH，Dudek FE. When and how do seizures kill neurons，and is cell death relevant to epileptogenesis？ [J]. Adv Exp Med Biol，2014，813：109-122.

[19]  Rami A，Benz AP，Niquet J，et al. Axonal Accumulation of Lysosomal-Associated Membrane Protein 1（LAMP1）Accompanying Alterations of Autophagy Dynamics in the Rat Hippocampus Upon Seizure-Induced Injury [J]. Neurochem Res，2016，41（1/2）：53-56.

[20]  Cabrera-López C，Martí T，Catalá V，et al. Assessing the effectiveness of rapamycin on angiomyolipoma in tuberous sclerosis： a two years trial [J]. Orphanet J Rare Dis，2012，7（1）：1-9.

[21]  Li Q，Ying H，Du J，et al. Alterations of apoptosis and autophagy in developing brain of rats with epilepsy：Changes in LC3，P62，Beclin-1 and Bcl-2 levels [J]. Neurosci Res，2018，130：47-55.

[22]  da Concei？觭？觔o RR，de Souza JS，de Oliveira KC，et al. Evaluation of neuroglobin and cytoglobin expression in adult rats exposed to silver nanoparticles during prepubescence [J]. Metab Brain Dis，2019，34（3）：705-713.

[23]  Baez E，Echeverria V，Cabezas R，et al. Protection by Neuroglobin Expression in Brain Pathologies [J]. Front Neurol，2016，7：146-156.

[24]  Emara M，Turner AR，Allalunisturner J，et al. Hypoxia differentially upregulates the expression of embryonic，fetal and adult hemoglobin in human glioblastoma cells [J]. Int J Oncol，2014，44（3）：950-958.

[25]  Cai B，Li W，Mao X，et al. Neuroglobin Overexpression Inhibits AMPK Signaling and Promotes Cell Anabolism [J]. Mol Neurobiol，2016，53（2）：1254-1265.

[26]  Simon R. Neuroglobin：neuroprotection and neurogenesis [J]. Neurosci Lett，2013，549（33）：1-2.

[27]  張蓓，李亚军，张世俊，等.脑缺血后脑红蛋白的保护作用及信号转导机制[J].华中科技大学学报，2012，41（5）：566-568.

[28]  Zhang B，Ji X，Zhang S，et al. Hemin mediated neuroglobin induction exerts neuroprotection following ischemic brain injury through PI3K/Akt signaling [J]. Mol Med Rep，2013，8（2）：681-685.

[29]  Amri F，Ghouili I，Amri M，et al. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death [J]. J Neurochem，2017， 140（1）：151-169.

（收稿日期：2019-05-20  本文编辑：王晓晔）