EZH2在大鼠睾丸扭转后缺血再灌注损伤中的作用及机制

钟云萍 张健健 王磊 刘修恒

武漢大学人民医院泌尿外科，湖北武汉   430060

[摘要] 目的 探讨Zeste同源物增强子2（EZH2）在大鼠睾丸扭转复位后缺血再灌注损伤中的作用及机制。 方法 18只成年健康雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、缺血组和EZH2抑制剂组，每组6只。对照组：将游离后的睾丸顺时针扭转720°后立即复位、固定;缺血组和EZH2抑制剂组：将游离后的睾丸顺时针扭转720°，维持2 h后将扭转的睾丸复位、固定。EZH2抑制剂组在扭转造模前腹腔注射EZH2抑制剂UNC1999 [50 mg/（kg·d）]，连续3 d。对照组和缺血再灌注组腹腔注射同体积磷酸缓冲盐溶液（PBS）。各组大鼠在扭转再复位4 h后处死，获取缺血后的睾丸组织，检测三组睾丸组织中的超氧化物歧化酶活性（SOD）和丙二醛（MDA）含量;苏木精-伊红染色和原位末端转移酶标记技术法观察组织病理学改变和生精细胞凋亡指数（AI）;免疫蛋白印迹检测各组睾丸组织EZH2、核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）的表达水平。 结果 与对照组比较，缺血组和EZH2抑制剂组在睾丸复位后SOD活性下降，Nrf2、HO-1表达降低，MDA、AI、EZH2水平升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与缺血组比较，EZH2抑制剂组的SOD活性升高，Nrf2、HO-1的表达升高，MDA、AI、EZH2水平降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 EZH2在睾丸缺血再灌注过程中发挥重要作用，EZH2抑制剂可保护睾丸扭转复位后的缺血再灌注损伤，其机制可能是通过增强Nrf2/HO-1通路、抑制细胞凋亡来实现。

[关键词] Zeste同源物增强子2;睾丸;扭转;缺血

[中图分类号] R726.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）10（a）-0021-04

Effect of EZH2 on testicular ischemia-reperfusion injury in rats

ZHONG Yunping   ZHANG Jianjian   WANG Lei   LIU Xiuheng

Department of Urology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province，Wuhan   430060， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of EZH2 on testicular ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Eighteen adult healthy male SD rats were randomly divided into control group， ischemia group and EZH2 inhibition group， 6 rats in each group. The free testicles were immediately repositioned and fixed after clockwise torsion of 720° in control group. The free testicles were rotated torsion of 720° and maintained for 2 h in ischemia group and EZH2 inhibition group. Before clockwising torsion， EZH2 inhibitor group was intraperitoneally injected with E2H2 inhibitor UNC1999 [50 mg/（kg·d）] for 3 days， while the control group and ischemia group were intraperitoneally injected with the phosphate buffer saline （PBS） of same volume. Rats in each group were sacrificed after 4 h of torsion and reposition， and the ischemic testicular tissues were obtained. The levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） were measured. Histopathoiogical changes and germ cell apoptosis indices （AI） were observed using hematoxylin-eosin staining and in situ terminal transferase labeling technique. The expressions of EZH2， NF-E2-related factor 2 （Nrf2） and heme oxygenase-1 （HO-1） were detected using Western blot. Results Compared with control group， the activity of SOD and the expression of Nrf2 and HO-1 were decreased after reduction， the expressions of MD， AI and EZH2 were increased in ischemic group and EZH2 inhibitor group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Compared with ischemic group， the activity of SOD and the expression of Nrf2 and HO-1 were increased after reduction， the expressions of MDA， AI and EZH2 were decreased in EZH2 inhibitor group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion EZH2 plays an important role in testicular ischemia-reperfusion injury. EZH2 inhibitor exerts a beneficial effect of testicles torsion repositioned after ischemia-reperfusion injury. This effect may be achieved through enhancing Nrf2/HO-1 expression and inhibiting apoptosis.

[Key words] Zeste homologous enhancer 2; Testicle; Torsion; Ischemia

Zeste同源物增强子2（EZH2）是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因[1]，定位于人类染色体7q35-7q36区间上，是多梳家族（polycomb group，PcG）的重要成员之一，具有促进癌细胞生长、分化、增殖及控制肿瘤细胞局部浸润、转移等重要作用[2]。睾丸扭转是青少年泌尿外科的常见急症之一[3-4]。如果扭转的睾丸在6 h内不能复位恢复血供，则扭转睾丸的生精细胞会发生不可逆性损伤[5-6]。即使手术复位及时，患者术后仍有可能出现扭转侧睾丸的生精功能下降，甚至出现睾丸萎缩[4，7]，其机制与睾丸扭转再复位后的缺血再灌注过程紧密相关[8]。近年来关于EZH2在器官缺血再灌注损伤中的作用研究较多，但在睾丸缺血再灌注损伤中的作用，目前尚无相关报道。因此，本研究旨在探讨EZH2在睾丸缺血再灌注中的作用及机制，为临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康雄性SD大鼠18只，体重250～300 g，购自武汉大学医学院实验动物中心（合格证号：420098000 01176）。动物实验方案经武汉大学人民医院动物实验医学伦理委员会批准。EZH2抑制剂UNC1999购于MedChemExpress公司。Nrf2、HO-1、EZH2抗体购于Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度试剂盒（P00105，0405 17170901）购于碧云天生物技术研究所。总超氧歧化酶（SOD）测定试剂盒（20180109），丙二醛（MDA）测定试剂盒（20180620），TUNEL凋亡原位检测试剂盒（TE331C9），购自南京建成生物工程研究所。

1.2 模型的建立与分组

18只成年健康雄性SD大鼠按照隨机数字表法分为对照组、缺血组和EZH2抑制剂组，每组6只。各组大鼠在麻醉后取下腹部直切口，仔细游离左侧睾丸后，切断睾丸引带并分离至附睾头。对照组：将游离后的睾丸顺时针扭转720°后立即复位、固定;缺血组和EZH2抑制剂组：将游离后的睾丸顺时针扭转720°，维持2 h后将扭转的睾丸复位、固定。EZH2抑制剂组在扭转造模前腹腔注射EZH2抑制剂UNC1999[50 mg/（kg·d）]，连续3 d。对照组和缺血组腹腔注射同体积的磷酸缓冲盐液（PBS）。

1.3 样本采集和处理

1.3.1 样本采集  各组大鼠在扭转再复位4 h后处死，获取缺血后的睾丸组织，一部分迅速置于液氮中保存;另一部分迅速置于固定液中固定24 h，石蜡包埋后切片，检测睾丸的病理学变化和生精细胞凋亡指数（AI）。

1.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量检测  获取的各组睾丸组织标本按照南京建成检测试剂盒的操作步骤检测。

1.3.3 AI检测  获取的各组睾丸组织标本按照试剂盒的操作步骤进行原位末端转移酶标记技术（TUNEL）染色，然后在光学显微镜下观察。细胞核呈棕黄色者为凋亡阳性细胞，在光学显微镜下随机选取5个视野，计算凋亡阳性细胞的数量，AI为阳性细胞数量与总细胞数量的比值。

1.3.4 组织病理学检查  获取的各组睾丸组织标本经多聚甲醛固定后，依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡等操作，待苏木精-伊红染色（HE染色）完成后，在200倍光学显微镜下观察其病理变化。

1.3.5 Bax、Bcl-2蛋白的表达结果  获取的各组睾丸组织标本后使用BCA法计算各组蛋白浓度。取40 μg不同分组的蛋白样本上样，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、转膜和封闭，加入EZH2、核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1），稀释比例为1∶1000， 4℃下摇床孵育过夜，与相应二抗按照1∶2000的比例稀释，孵育1 h，洗膜，增强化学发光法（ECL）显色、照相。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组睾丸组织SOD活性、MDA含量及AI测定结果比较

缺血组和EZH2抑制剂组的SOD活性均显著低于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）;缺血组和EZH2抑制剂组的MDA含量显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）;EZH2抑制剂组SOD活性明显高于缺血组，MDA含量明显低于缺血组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。缺血组的AI显著高于对照组和EZH2抑制剂组，差异有统计学意义（P < 0.05）;EZH2抑制剂组的AI显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1、表1。

注：与对照组比较，*P < 0.05;与缺血组比较，#P < 0.05。EZH2：Zeste同源物增强子2;SOD：超氧化物歧化酶;MDA：丙二醛;AI：凋亡指数

2.2 三组睾丸组织病理学检查结果比较

缺血组睾丸曲细精管直径变小，生精上皮细胞排列紊乱，细胞层数及数量减少，生精阻滞。EZH2抑制剂组组织病理学检查结果较缺血组有所缓解。见图2。

2.3 三组睾丸组织Western blot检测结果比较

缺血组Nrf2、HO-1蛋白的表达明显低于对照组和EZH2抑制剂组，EZH2抑制剂组Nrf2、HO-1蛋白的表达明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。缺血组EZH2蛋白的表达明显高于对照组和EZH2抑制剂组，EZH2抑制剂组EZH2蛋白的表达明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图3、表2。

A：对照组;B：缺血组;C：EZH2抑制剂组。EZH2：Zeste同源物增强子2;Nrf2：核因子E2相关因子2;H0-1：血红素氧合酶-1

注：与对照组比较，*P < 0.05;与缺血组比较，#P < 0.05。EZH2：Zeste同源物增强子2;Nrf2：核因子E2相关因子2;H0-1：血红素氧合酶-1

3 讨论

睾丸扭转再复位造成的缺血损伤是不可逆转的，最终会导致不育[9]。睾丸扭转复位会发生典型的睾丸缺血再灌注损伤，导致扭转睾丸的生精细胞发生代谢性损伤，如氧自由基损伤、炎症因子释放、基因转录表达异常等病理生理学改变[10]。虽然正常睾丸细胞可产生氧自由基，但是在缺血再灌注过程中氧自由基的过量生成会对睾丸细胞的功能造成损害[11]。机体存在的抗氧化系统可以清除一定的氧自由基及其代谢产物，而当缺血再灌注过程中氧自由基大量生成，体内氧化/抗氧化系统之间的平衡会被破坏[12-13]。因此，清除睾丸扭转再复位中的氧自由基对减轻缺血造成的氧化损伤至关重要[14]。

EZH2是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因，定位于人类染色体7q35-7q36区间上，是PcG基因家族的重要成员之一。EZH2可通过甲基化修饰核小体组蛋白H3的第27位赖氨酸，沉默相关基因表达，影响疾病的发生和发展。EZH2在器官缺血再灌注损伤中发挥重要作用。Miti等[15]发现EZH2在肢体缺血再灌注损伤中表达升高，通过组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化（H3K27me3）修饰可抑制血管生成基因内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，从而加重缺血再灌注损伤。Gong等[16]发现在乳腺癌中，EZH2介导的H3K27me3修饰可抑制FoxO3A蛋白的表达，促进肿瘤的侵袭和发展。本研究发现，在睾丸扭转再复位后缺血再灌注损伤过程中EZH2表达升高，说明EZH2在睾丸缺血再灌注过程中发挥重要作用。抑制EZH2的表达，可明显减轻睾丸缺血再灌注损伤，升高因缺血导致的SOD活性，降低MDA含量;同时抑制EZH2表达可改善缺血后的睾丸曲细精管直径变小、生精上皮细胞排列紊乱等组织病理学改变，说明EZH2促进睾丸缺血再灌注损伤与增强氧化应激损伤有关。

生理状态下，Nrf2与Keap1相结合形成复合体，使Nrf2经泛素蛋白酶途径降解[17-18]。当发生睾丸缺血再灌注损伤时，氧化应激可引起Nrf2与其接头蛋白Keap1复合体解离，Nrf2从细胞质转位到细胞核，启动抗氧化基因的表达，HO-1是受Nrf2调控的重要酶类，形成Nrf2/HO-1通路[19-20]。本研究发现，当发生睾丸缺血再灌注损伤时，Nrf2/HO-1表达下调，细胞AI升高，SOD水平下降、MDA含量上升。而当抑制EZH2表达后，Nrf2/HO-1表达水平上升，细胞凋亡明显减轻，SOD水平上升、MDA含量下降。说明睾丸缺血再灌注损伤中，通过增强Nrf2/HO-1表达水平，抑制氧化应激反应，减轻睾丸生精细胞凋亡，抑制EZH2的表达。

综上所述，EZH2抑制剂对睾丸扭转再复位后的缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能是通过增强Nrf2/HO-1通路的表达、抑制细胞凋亡而实现，提示EZH2抑制剂可作为治疗睾丸缺血再灌注损伤的药物。

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（收稿日期：2019-04-23  本文编辑：任   念）