超薄切片不同制备方法和茶代铀进行心肌淀粉样变性的电子染色

赵然旭 魏英杰 李莉 王清峙 陆洋 徐红宇 有一伟

[摘要] 目的 檢测乌龙茶提取物是否可作为电子染色剂取代醋酸双氧铀用于心肌淀粉样变染色，并在染色过程当中使用不同的染色方法，改进制备方法，比较其安全性与高效性。 方法 收集中国医学科学院阜外医院2017年1～12月临床怀疑淀粉样变性的病例共计40例，其中心肌组织经病理学观察和特殊染色呈阳性者10例。利用树脂812常规包埋和改进后方法对心肌组织进行制备，再在复染铅与不复染铅这两种情况下对超薄切片样品进行两种不同染色剂（3%醋酸双氧铀水溶液、0.5%乌龙茶提取物）和两种不同染色方法（滴染法、切片盒染色法）的电子染色，然后在透射电子显微镜下观察比较其不同之处。 结果 复染铅的情况下，在透射电子显微镜下心肌中淀粉样物质，利用2种电子染色剂和改进后的制备方法进行染色的结果均较理想，切片背景干净，对比度高，所获图像清晰。 结论 在观察心肌淀粉样变中，乌龙茶提取物配合切片盒染色与改进后的制备方法，可以更加安全、快速地替代醋酸双氧铀进行透射电子显微镜电子染色。

[关键词] 乌龙茶提取物;醋酸双氧铀;心肌淀粉样变;透射电子显微镜

[中图分类号] R737.14          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）10（a）-0017-04

Electron staining of myocardial amyloidosis by different preparation methods and tea instead of uranium

ZHAO Ranxu1   WEI Yingjie1   LI Li2   WANG Qingzhi2   LU Yang2   XU Hongyu2   YOU Yiwei2

1.Department of Electron Microscopy Platform of National Key Laboratory of Cardiovascular Diseases， Chinese Academy of Medical Sciences  Peking Union Medical College  National Center for Cardiovascular Diseases  Fuwai Hospital， Beijing   100037， China; 2.Department of Pathology，  Chinese Academy of Medical Sciences  Peking Union Medical College  National Center for Cardiovascular Diseases  Fuwai Hospital， Beijing   100037， China

[Abstract] Objective To test whether oolong tea extract can be used as an electronic stain instead of uranyl acetate （UA） for myocardial amyloidosis staining. In the process of staining， different staining methods were used and improve the preparation methods and compare their safety and efficiency. Methods A total of 40 cases of clinically suspected amyloidosis were collected from Fuwai Hospital of the Chinese Academy of Medical Sciences from January to December 2017， and 10 cases of cardiac tissue positive after pathological observation and special staining. The myocardial tissues were prepared by conventional encapsulation and improvement of resin 812， and then two kinds of different stains （3% uranyl acetate solution， 0.5% oolong tea extract） were applied to the ultrathin section samples under the conditions of counterstaining lead or not counterstaining lead， and two different staining methods （drip method， slice box staining） electronic staining， and then the differences were compared under a transmission electron microscope. Results Under the condition of repeated staining of lead， the results of staining of amyloid substance in myocardium with two kinds of electron staining agents and the improved preparation method were all satisfactory. The background of the slice was clean， the contrast was high and the obtained image was clear. Conclusion In the observation of myocardial amyloidosis， oolong tea extract with section box staining and the improved preparation method can more safely and quickly replace dioxide-uranium acetate for transmission electron microscope electron staining.

[Key words] Oolong tea extract; Uranyl acetate; Myocardial amyloidosis; Transmission electron microscopy

透射电子显微镜简称透射电镜，是医学生物学研究的重要工具，在积累了一定的基础研究数据后[1]，研究者们逐渐开始在人类心脏病组织中，使用透射电镜技术对疾病超微结构的改变进行观察。例如心肌淀粉样变性，一类包括遗传性或获得性的疾病[2-4]，主要特征是错误折叠的蛋白质呈淀粉样沉积在心脏。现在这类代谢性疾病在心脏疾病中很常见，目前，心肌活检标本的病理诊断多采用苏木精-伊红染色法辅以免疫组织化学的方法通过光学显微镜进行，但仍有部分病例难以明确诊断，需采用电镜进行明确诊断。

20世纪50年代，华生首次将醋酸铀用作电子显微镜染色剂[5-6]，此后它在电子显微镜染色中得到了广泛的应用。但长时间以来，铀对操作者健康的伤害，操作的繁琐，储存环境的要求之高以及废液的处理不易等问题都没有得到很好的解決，因此试图寻找一种染色方法取代醋酸铀的染色。为了解决前面提到的问题，一些研究者做了很多尝试，Kajikawa等[7]使用单宁酸作为替代品，但使用单宁酸不能深入渗透到组织中，这个方法只能在薄片中使用。Tanaka（田中）和Nakamura（中村）[8]比较了四种电子染色方法，单宁酸染色、orcein染色、钯氯化物染色剂和铁苏木精染色剂在超薄切片中的弹性纤维。结果提示单宁酸染色是最好的。2003年，Sato等[9]得出结果显示乌龙茶提取物（OTE）染色方法在肺组织的观察中优于丹宁酸。几年后，Carpentier等[10]改进了这一方法，他们将这种方法结合到微波炉中观察植物组织。OTE用作醋酸铀的替代品已被用于某些领域，例如观察动物组织植物组织和微孢子虫。本研究使用了OTE[11-12]作为醋酸铀的替代品，配合自制的染色器具，改进了制备方法，安全、快速地用于心肌淀粉样变当中。

1 材料与方法

1.1 样本收集

收集中国医学科学院阜外医院2017年1～12月临床怀疑淀粉样变性的病例40例，其中男28例，年龄22～73岁，平均（51.55±11.02）岁;女性患者12例，年龄35～68岁，平均（56.09±10.55）岁。10例患者心肌组织经病理学观察和刚果红染色呈阳性，其中男8例，年龄37～73岁，平均（55.13±10.35）岁;女2例，年龄52～65岁，平均（58.50±9.19）岁。以上实验所取样本通过了患者的知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂  醋酸铀粉末（批号：71-031，中国国药试剂）;OTE粉末（批号：日本特许5199220号，日本日新公司）。

1.2.2 主要仪器  透射电子显微镜（型号：JEM 1010，日本电子）;CCD（型号：Gatan 830，美国Gatan公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备方法  将怀疑心肌淀粉样变的组织分为两组，一组经过常规病理检查，刚果红染色阳性者列入本研究。检测后相对应的另一组样本，一种经常规812树脂包埋法制样;另一种用改进后的方法制备样品。两种方法制成的胶块均进行连续超薄切片，待染色用。

1.3.2 超薄切片染色方法  使用滴染法：培养皿中铺平封口膜，然后用一次性针管均匀滴上10滴染液，并试用不同染色剂染色。过程中要不断更换封口膜。①3%醋酸铀染液染色15～20 min。②0.5%的乌龙茶提取物缓冲液（pH 7.4）（0.1 mol/L的PBS配置而成）染色20～30 min。染色后，超薄切片分别用蒸馏水进行清洗，切片上水分稍干后把以上切片分成两组：一组待用于直接观察，一组进行柠檬酸铅的复染15～20 min后进行观察。

使用切片盒染色法：培养皿中灌注石蜡，在未干燥之前，用切片盒压制出相符合的形状，铸成染色模具，然后把切片盒（北京中兴百瑞技术有限公司）打孔，把待染切片依次，顺序放入切片盒，进行如上染色，最后进行观察。

1.4 电镜观察

所有切片均使用JEM 1010，在加速电压80 kV下，用CCD进行观察。

2 结果

2.1 光镜检测结果

40例心肌组织染色后证实有淀粉样物质沉积者10例。见图1（封四）。

2.2 不同试剂配伍染色结果

图2可见，使用常规电镜染色方法，铅、铀双染法，在电镜观察不同倍数下（图2A～C为传统方法染色的心肌淀粉样变整体图，C图设为阳性对照），可以清楚地将心肌组织中沉淀的淀粉样物质染色。而只进行柠檬酸铅单独染色显示结果呈阴性（图2D）。醋酸双氧铀与柠檬酸铅复染的心肌淀粉样变图，淀粉样物质染色结果清晰（图2E）。并且无论是单独铀染色（图2F），还是乌龙茶提取物代替醋酸铀配伍铅的染色方法和茶单独染色（图2G～H），均可以将心肌组织中沉淀的淀粉样物质染色。本实验中，茶铅的配伍染色不仅可以将淀粉样物质染色，还可以将组织中的线粒体、肌丝、细胞间质等基本结构染色。加上铅的复染，两种染色结果（图2E～I）均相同，淀粉样物质清晰可见。

2.3 不同染色方法染色结果

在严格控制污染的情况下，用滴染法独立完成连续50张超薄切片的染色，需要耗时约4.5 h，每种染液约消耗1 mL;切片盒法耗时约1 h，每种染液约消耗约10 mL。在电镜下观察，两种染色方法的染色结果均较理想，切片背景干净、对比度高，所获图像清晰。

在研究中采用改进后样品制备方法比常规包埋方法缩短了2/3的时间（表1），制片后的染色结果相同。

3 讨论

生物样品的超薄切片染色在电镜标本制备过程中十分关键[13-15]，然而染色不慎造成的切片污染、染色不均时有发生。为了得到满意的染色结果，电镜工作者开发了多种染色方法及装置并不断进行改进。本实验室采用的就是简易自制装置——切片盒配伍石蜡模具，进行封闭式浸染。切片盒染色法的优点是铜网放置简单、顺序清楚、数量多，且每张铜网空间相对独立，有效防止了切片错乱及脱落，而且安全性及便利性较高。但冲洗需注意切片盒盖与底板的小孔对齐，以保证清洗干净，冲洗时间要较滴染法的时间稍延长。除此之外超薄切片的染色效果还受多种因素影响，如染色液的浓度、温度、pH值;一些技术因素，如固定剂和嵌入媒体[16]。因此本研究改进样品的制备方法，减少了步骤，节省了时间，用于茶代铀的染色，更快速、安全地完成心肌活检淀粉样变的染色。既往的研究[17-19]表明OTE多酚不能进入细胞并伤害细胞膜，但它们的肽键反应和透射电子显微镜中的染色均增强。本研究结果提示，虽然采用OTE单染色和配伍铅双染色可以显示大部分心肌组织结构，与传统染色方法相比，一些结构仍然可以观察到细节上的差异，但淀粉样物质染色清晰，而且考虑到安全性因素，OTE是电子染色中醋酸铀的非常有前景的替代品[20]。

[参考文献]

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（收稿日期：2019-05-05  本文编辑：刘永巧）