温郁金中5种成分的含量测定及其产地加工方法优化

周爱珍 鲍珍贝 程斌 朱晓琪

中圖分类号 R283 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）03-0381-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.20

摘 要 目的：建立同时测定温郁金中莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯含量的方法，并优化其产地加工方法。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法。色谱柱为ODS SP C18，流动相为乙腈-0.05 %磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。将新鲜温郁金药材经蒸/煮（10、20、30、40 min）、烘干（温度分别为50、60、70 ℃）后制备18批样品药材并测定各批药材中5种成分的含量；以灰色关联分析法得到的相对关联度（ri）为评价指标，优选温郁金药材的最优产地加工方法。结果：莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯的检测质量浓度线性范围分别为25.56～409.0、2.05～32.8、6.36～102.0、9.14～146.0、8.62～138.0 μg/mL（r均≥0.999 2），精密度、稳定性、重复性试验的RSD均<2.0%（n=6）；定量限分别为0.34、0.62、0.11、0.14、1.20 μg/mL，检测限分别为0.10、0.19、0.03、0.04、0.42 μg/mL；平均加样回收率分别为101.3%、98.7%、99.0%、99.6%、96.4%（RSD均<2.8%，n=6）；灰色关联分析结果显示，煮10 min-50 ℃烘干的加工方法的ri最大，对温郁金药材中莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯含量影响最小。结论：HPLC法可用于温郁金药材中5种成分的含量测定，本次优化结果可为温郁金药材产地加工方法的选择提供参考。

关键词 温郁金；含量测定；产地加工；高效液相色谱法；灰色关联度分析法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of curdione， curcumenol， germacrone， furanodiene and β-elemene in Curcuma wenyujin， and to optimize its processing method in production place. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on ODS SP C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 214 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. 18 batches of sample medicinal materials were prepared by steaming-drying （10， 20， 30， 40 min）， or cooking-drying （drying temperature 50， 60， 70 ℃）， and then the contents of 5 components were determined. Relative relational degree （ri） obtained by grey relational analysis method as indexes was used to optimize the processing methods of C. wenyujin in production place using. RESULTS： The linear range of curdione， curcumenol， germacrone， furanodiene and β-elemene were 25.56-409.0， 2.05-32.8， 6.36-102.0， 9.14-146.0， 8.62-138.0 μg/mL （r≥0.999 2）， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. Quantitative limits were 0.34， 0.62， 0.11， 0.14 and 1.20 μg/mL， and detection limits were 0.10， 0.19， 0.03， 0.04 and 0.42 μg/mL， respectively. The average recoveries were 101.3%， 98.7%， 99.0%， 99.6%， 96.4%， respectively （RSD<2.8%， n=6）. The results of grey relational analysis showed that the relative relational degree （ri） from the processing technology of “boil for 10 min-drying at 50 ℃” was greatest， which had relatively small comprehensive effect on the contents of curdione， curcumenol， germacrone， furanodiene and β-elemene respectively. CONCLUSIONS： Established HPLC method can be used for content determination of 5 components in C. wenyujin. The results of optimization can provide reference for the selection of processing method of C. wenyujin in production place.

KEYWORDS Curcuma wenyujin； Content determination； Processing in production place； HPLC； Grey relational analysis method

温郁金为姜科植物温郁金（Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling）的干燥块根，其性寒，味辛、苦，归肝、心、肺经，是一味具有活血止痛、行气解郁、清心凉血、利胆退黄功效的临床常用中药，主治胸腹刺痛、胸痹心痛、经闭痛经、乳房胀痛、黄疸尿赤等[1]。现代研究表明，温郁金药材所含的主要活性成分以倍半萜类化合物为主[2]，具有抗肿瘤、抗血栓、抗炎等多种药理活性，如莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮（吉马酮）、呋喃二烯、β-榄香烯等均具有较强的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用[3-5]；莪术二酮、莪术醇、β-榄香烯等具有抗血栓、改善血液循环等作用[6-8]；莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮等具有显著的抗炎镇痛作用[9-11]。鉴于温郁金显著的药理活性，其开发和应用愈来愈受到广泛关注[2]。

道地药材的加工方法是形成中药材道地性的关键因素之一，直接关系到道地药材的质量，尤其是现阶段道地药材规模化、产业化的迅速发展，落后的加工水平已经成为制约其发展的瓶颈[12]。温郁金作为传统的“浙八味”药材，主产地在浙江温州，已有近900年的栽培历史[13]。关于郁金药材的加工和质量标准，2015年版《中国药典》（一部）（以下简称“药典”）规定的加工方法为冬季茎叶枯萎后采挖，除去泥沙和细根，蒸或煮至透心，然后干燥即得；质量标准中仅规定了性状鉴别、显微和色谱鉴别、水分和总灰分测定检查项[1]，缺乏含量测定等关键性的质控项目。本课题组通过对瑞安、乐清等温郁金药材产地的调研发现，各地的加工方法主要是采用清水煮后晒干法（清水煮后，挑选较大者折断，用指甲掐其内心，如无响声或粉质稍微熟透，捞出、晒干即得）。无论是药典收载的加工方法，还是传统的产地加工方法都缺乏具体、可控的技术参数，农户操作随意性大，操作过程和成品质量仅凭农户主观经验判断，其产地加工工艺亟待规范化和产业化。

由于温郁金的采收季节在冬季，气温相对较低，对于富含淀粉（30%～40%）的新鲜温郁金药材而言，若不经过蒸或煮的加工处理，则很难晒干，极易出现腐烂变质的现象，传统方法加热处理后易于干燥和保存，适合产地实际情况。本文在前期调研和预试验的基础上，参考相关研究[2-11]中药理作用显著且含量相对较高的莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯5种成分为评价指标，采用高效液相色谱（HPLC）法建立温郁金药材中5种活性成分的含量测定方法，并结合灰色关联分析法对温郁金药材的产地加工方法进行综合评价，为规范道地药材温郁金的产地加工和品质评价提供试验依据。

1 材料

1.1 仪器

DGU-20A系列HPLC系統（日本岛津有限公司）；XS105电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BS124 S电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；YF-150B粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；CT-C热风循环烘箱（江苏江阴江拓机械设备有限公司）；ZGY-500可倾式蒸煮锅（台州春江制药机械有限公司）；DSH-50快速水分测定仪（上海越平科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

莪术二酮（批号：111800-201302，纯度：99.8%）、莪术醇（批号：100185-201007，纯度：99.9%）、牻牛儿酮（批号：111665-201605，纯度：99.8%）、呋喃二烯（批号：111824-201102，纯度：99.4%）、β-榄香烯（批号：100268- 201402，纯度：99.4%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；温郁金新鲜药材于2018年1月采集，产地为浙江省温州市陶山镇，经浙江医药高等专科学校杨雄志教授鉴定为姜科植物温郁金的块根。

2 方法与结果

2.1 温郁金药材的不同加工方法

本课题组结合前期预试验，分别称取新鲜温郁金药材500 g，于蒸煮锅内加入10倍量冷水，以沸腾时开始计时，按表1中的不同加工方法对温郁金样品进行处理，采用热风循环加热烘干至含水量为12%左右（药典规定不超过15%[1]）取出，放冷，密封包装，置于阴凉干燥处保存，备用。

2.2 莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为ODS SP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，50%→60%A；20～25 min，60%→65%A；25～30 min，65%→80%A；30～38min，80%A；38～40 min，80%→90%A；40～50 min，90%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为214 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.2.2 溶液的制备 （1）混合对照品溶液的制备。分别取莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯对照品适量，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯质量浓度分别为0.852、1.025、0.848、0.914、1.724 mg/mL的单一对照品贮备液。分别精密吸取上述贮备液适量置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯的质量浓度分别为0.102、0.041、0.025、0.036、0.344 mg/mL的混合对照品溶液。（2）供试品溶液的制备。取S7温郁金药材粉末1.0 g，精密加入甲醇20 mL，密塞，称质量，超声（功率：200 W，频率：50 kHz）处理40 min，放冷；擦干外壁，密塞，再称质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液即得。

2.2.3 系统适用性考察 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果表明，各检测成分之间分离度均大于1.5，理论板数以莪术二酮峰计不小于20 000。2种溶液的高效液相色谱图见图1。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯单一对照品贮备液各2.4、0.16、0.6、0.8、0.4 mL，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；采用2倍稀释法稀释获得5个质量浓度的系列对照品溶液后，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品的质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。结果，莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯的检测质量浓度线性范围分别为25.56～409.0、2.050～32.80、6.360～102.0、9.145～ 146.0、8.620～138.0 μg/mL（r均≥0.999 2，n=5），5种成分线性关系考察结果见表2。

2.2.5 检测限及定量限考察 精密吸取“2.2.2”项下的单一对照品贮备液适量，逐级稀释后，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，在信噪比（S/N）为3时计算检测限，S/N为10时计算定量限，结果见表2。

2.2.6 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下的混合对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果，莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯峰面积的RSD分别为0.12%、0.18%、0.12%、0.09%、0.69%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取“2.2.2”项下的供试品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录色谱图。结果，莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯峰面积的RSD分别为0.88%、1.70%、0.49%、0.54%、1.90%（n=6），表明样品在24 h内具有较好的稳定性。

2.2.8 重复性试验 取S7样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算含量。结果，莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯含量的RSD分别为1.6%、1.9%、1.5%、1.1%、1.4%（n=6），表明方法的重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的S7样品0.5 g，分别加入等量的对照品，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法平行制备6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分的加樣回收率及其RSD。结果显示，莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯平均加样回收率分别为101.3%、98.7%、99.0%、99.6%、96.4%，RSD分别为2.6%、1.7%、2.7%、2.3%、1.3%（n=6），详见表3。

2.3 样品测定结果及分析

分别取温郁金不同方法加工的药材（S1～S18）粉末1.0 g，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法平行制备3份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算温郁金不同方法加工药材中5种成分的含量，结果见表4。

根据表4中的结果，以各样品所含莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯和β-榄香烯的含量为纵坐标，温郁金不同加工方法（煮-烘干、蒸-烘干）为横坐标绘制关联图，结果见图2。

由表4及图2可知，采用煮-烘干工艺加工温郁金药材时，煮10 min-50 ℃烘干工艺制得的样品（S1）中莪术二酮、牻牛儿酮、呋喃二烯和β-榄香烯的含量最高，煮20 min-50 ℃烘干工艺制得的样品（S4）中莪术醇含量最高；采用蒸-烘干工艺加工温郁金药材时，蒸20 min-50 ℃烘干工艺制得样品（S10）中莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯和β-榄香烯的含量最高，蒸20 min-60 ℃烘干工艺制得的样品（S11）中莪术二酮的含量最高。煮-烘干、蒸-烘干工艺的比较结果可知，煮10 min-50 ℃烘干工艺制得的样品（S1）中莪术二酮、牻牛儿酮的含量最高，煮20 min-50 ℃烘干工艺制得的样品（S4）中莪术醇含量最高，而蒸20 min-50 ℃烘干工艺制得样品（S10）中呋喃二烯、β-榄香烯的含量最高。

2.4 温郁金药材不同加工方法与活性成分含量灰色关联分析

基于“2.3”项下结果可知，仅凭1～2个指标成分含量高低难以客观地优选出温郁金药材的最佳加工方法，因此，笔者采用灰色关联分析法[14]，应用DPS 7.5统计软件对温郁金药材不同加工方法与莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯和β-榄香烯等活性成分的含量等进行灰色关联分析，以综合评价不同加工方法对上述成分含量的影响，从而优选出最佳的温郁金药材加工方法。

2.4.1 参考序列的选择 根据灰色关联理论[14]，笔者将温郁金药材的活性成分作为一个灰色系统，不同的活性成分为子系统，每个活性成分的含量为一个灰元（元素），进行关联分析计算。设有样品数n个，每个样品的评价指标有m项，即组成评价单元序列{Xik}，（i=1，2，3……，n；k=1，2，3……，m；本研究中温郁金药材样品数 n=18，活性成分数m=5）。设最优参考序列为{Xsk}，由n个样品对应指标的最大值组成；最差参考序列为{Xtk}，由n个样品对应指标的最小值组成（k=1，2，3……m）。

2.4.2 原始数据的格式化处理 由于各含量指标间独立性的问题[15]，本文采用均值化变换，将原始数据按公式①Yik=Xik/Xk（Yik为规格化处理后的数据，Xik为原始数据，Xk为n个样品第k个指标的均值）进行格式化处理，结果见表 5。