茉莉酸甲酯对滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量的影响

2019-10-19金琳李海峰刘卫红胡侃

中国药房 2019年3期

金琳李海峰刘卫红胡侃

中圖分类号 R282.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）03-0344-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.13

摘要目的：研究外源性茉莉酸甲酯对滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质（龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷）含量及生理生化指标的影响，为茉莉酸甲酯在滇龙胆规范化种植中的应用提供科学依据。方法：分别以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯喷施滇龙胆植株2、4、6、8、10 d（喷施量均为500 mL）后，收集药材叶为样品材料，并收集相应时段未喷施处理的药材叶为对照。采用高效液相色谱（HPLC）法测定4个质量浓度下茉莉酸甲酯喷施10 d后滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量，优选茉莉酸甲酯的最佳喷施质量浓度（有效成分含量最高）。采用HPLC法测定以最佳喷施质量浓度茉莉酸甲酯喷施不同时间后滇龙胆叶4种裂环烯醚萜类物质的含量，并测定其中相关生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和丙二醛）水平。结果：以10、50、100、200 mg/L茉莉酸甲酯喷施滇龙胆植株10 d后，叶中4种裂环烯醚萜类物质的含量较未处理叶均不同程度增加，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯喷施后效果最好，此时叶中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量分别为未处理叶的1.88、2.36和1.87倍（P<0.05）。以100 mg/L茉莉酸甲酯喷施2、4、6、8、10 d后，叶中4种裂环烯醚萜类物质的含量均不同程度高于同时段未处理叶；在喷施4 d后叶中龙胆苦苷含量开始出现显著差异（P<0.05），在喷施6 d后叶中4种裂环烯醚萜类物质的含量总体较高，此时叶中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷含量分别为同时段未处理叶的1.88、1.88、1.47、1.82倍（P<0.05）；并自喷施4 d起，叶中各生理生化指标水平较未处理叶均显著升高（P<0.05）。结论：以100 mg/L茉莉酸甲酯喷施6 d后滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量升高最明显，这可能与其提高了叶中相关生理生化指标的水平有关。

关键词滇龙胆叶；高效液相色谱法；茉莉酸甲酯；裂环烯醚萜类物质；含量测定；生理生化指标

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of exogenous methyl jasmonate on the contents of 4 kinds of secoiridoid substance （gentiopicrin， swertiamain， sweroside and amarogentin） and biochemical indexes in the leaves of Gentiana rigescens， and to provide scientific evidence for the application of methyl jasmonate in standardized planting of G. rigescens. METHODS： 2， 4， 6， 8， 10 d after spraying 10， 50， 100， 200 mg/L methyl jasmonate （spraying amount was 500 mL） for G. rigescens strain， the leaves of medicinal material were collected as sample， and the other leaves without spraying methyl jasmonate were collected as control. HPLC method was used to determine the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens after spraying 4 kinds of concentrations of methyl jasmonate for 10 d. The concentration of methyl jasmonate was optimized （the content of effective component was the highest）. HPLC method was adopted to determine the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens after spraying the optimal concentration of methyl jasmonate for different time. The levels of relevant biochemical indexes （SOD， POD， CAT， MDA） were determined. RESULTS： 10 d after spraying 10， 50， 100， 200 mg/L methyl jasmonate for G. rigescens strains， the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves were increased to different extent. Compared with untreated leaves， 100 mg/L methyl jasmonate had the best effect after spraying， and the contents of gentiopicrin， swertiamain and sweroside in treated leaves were 1.88， 2.36 and 1.87 times of those in untreated leaves， respectively （P<0.05）. 2， 4， 6， 8， 10 d after spraying 100 mg/L methyl jasmonate， the contents of 4 kinds of secoiridoid substance in treated leaves were higher than untreated leaves at corresponding stage； the content of secoiridoid had significant difference after spraying for 4 d （P<0.05）. The contents of active components in general were relatively high after spraying for 6 d， and the contents of gentiopicrin， swertiamain， sweroside and amarogentin in treated leaves were 1.88， 1.88， 1.47， 1.82 times of those in untreated leaves， respectively （P<0.05）. The levels of relevant biochemical indexes in treated leaves were increased significantly since 4 d of spraying， compared with untreated leaves （P<0.05）. CONCLUSIONS： After spraying 100 mg/L methyl jasmonate for 6 d， the contents increase of 4 kinds of secoiridoid substance in the leaves of G. rigescens are most obvious， which may be associated with improving the levels of related biochemical indexes.

KEYWORDS Leaves of Gentiana rigescens； HPLC； Methyl jasmonate； Secoiridoid substance； Content determination； Biochemical indexes

滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.）又称坚龙胆、滇龙胆草，为龙胆科龙胆属多年生宿根草本植物[1]，以根及根茎入药，具有清热泻火、健脾、保肝等作用，主要用于治疗黄疸、小儿疳热、小便不利等症，是龙胆泻肝丸、龙胆注射液、小儿清热片等200多种中成药的原料药之一[2-4]。滇龙胆是云南道地药材，其次生代谢产物裂环烯醚萜类物质（如龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷等）为主要活性成分[5]，其中龙胆苦苷含量为2015年版《中国药典》（一部）规定的龙胆药材的质量控制指标[1]，龙胆苦苷含量的高低直接影响药材的品质及药用价值。从生物合成途径来看，在滇龙胆叶绿体中，牻牛儿基二磷酸酯通过羟基化氧化成柠檬醛，再经过环化、水合和还原形成臭蚁二醛，臭蚁二醛经过烯醇化、羟醛缩合和苷化成环烯醚萜苷，环烯醚萜苷通过环断裂、氧化内酯化最终形成裂环烯醚萜类物质[6]，故通过调节代谢途径提高滇龙胆中主要活性成分的含量具有现实意义。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate）是一种新型植物激素，在植物体内普遍存在，对一些重要的次生代谢过程起到调控作用[7]，目前已应用于多种药用植物（如三七[8]、茯苓[9]、苦玄参[10]、阳春砂[11]等）中，均能够诱导提高其相应萜类化合物的含量。因此，本试验拟以遗传性状相同的滇龙胆组织培养苗为研究对象，在人工栽培条件下，通过叶面喷施的方法，探索经不同质量浓度茉莉酸甲酯诱导后，滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量及相关生理生化指标[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）]水平的动态变化，为采用茉莉酸甲酯提高大田栽培滇龙胆中主要活性成分含量提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

1200高效液相色谱仪，包含G1313A ALS自动进样器、G1315A/B二极管阵列检测器、ChemStation色谱工作站（美国Agilent公司）；T6新世纪分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；TGL-16C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；AE240电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK5200H超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q Century系列纯水处理系统（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

以同一植株滇龙胆诱导的遗传性状相同的组织培养苗为试验药材（由大理大学药物研究所李海峰教授鉴定为龙胆科龙胆属滇龙胆植株）；龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龙胆酯苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：分别为ZJ0701BA13、M29J4S1、PN1125- SA13、Z06J6S2，纯度：均≥95%）；茉莉酸甲酯（美国Sigma公司，批号：24834483，纯度：≥95%）；甲醇（美国Tedia公司，色谱纯）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 滇龙胆叶样品的准备与处理

以大理州南涧县乐秋乡同一植株滇龙胆的越冬芽为外植株，经丛生芽增殖途径获得滇龙胆组织培养苗，将组织培养苗栽培3年后，选取状态良好、生长一致的滇龙胆植株，分为5个组（4个处理组和1个对照组），每个组间相互间隔5 m，有植株120～140株。在植株开花期分别用10、50、100和200 mg/L的茉莉酸甲酯各500 mL均匀喷洒在不同处理组的滇龙胆植株叶片2、4、6、8、10 d后，收集叶片，作为试验样品；并收集相应时段未喷施茉莉酸甲酯的植株（即对照组植株）叶片，作为对照。参照文献方法[12]，将采集的处理和未处理滇龙胆叶片于50 ℃烘箱中烘干至恒质量，将样品粉碎，过100目筛，30 ℃烘箱中干燥至恒质量，用封口袋避光保存，备用。

2.2 滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量测定方法的建立

2.2.1 溶液的制备（1）茉莉酸甲酯溶液。精密称取茉莉酸甲酯400 mg，用少量无水乙醇溶解后加水制成质量浓度为800 mg/L的母液；再精密吸取母液适量，加水稀释成质量浓度分别为10、50、100、200 mg/L的茉莉酸甲酯液[7]。（2）混合对照品溶液。精密称取龙胆苦苷对照品1.9 mg、獐牙菜苦苷对照品1 mg、獐牙菜苷对照品0.5 mg和苦龙胆酯苷对照品0.5 mg，分别置于1、2、10和10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀。分别精密吸取0.4、0.1、0.16和0.16 mL上述4种溶液，置于同一1 mL量瓶中，用甲醇定容，制成龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷质量浓度分别为0.76、0.05、0.008和0.008 mg/mL的混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，待用。（3）供试品溶液。精密称取药材粉末0.1 g，置于10 mL量瓶中，加入2 mL甲醇，于40 ℃超聲（功率：200 W，频率：40 kHz）处理20 min，滤纸过滤；滤渣用 2 mL甲醇按前述步骤重复处理1次，合并2次提取滤液至5 mL量瓶中，冷却至室温，加甲醇溶液充分混匀后定容，即得。

2.2.2 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～15 min，15%→35%A；15～40 min，35%→80%A）；检测波长：龙胆苦苷为274 nm，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龙胆酯苷均为243 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 ?L。取“2.2”项下溶液（供试品溶液为未处理的对照样品），在此色谱条件下进样测定。结果，供试品图谱中的特征峰与杂质峰分离良好（分离度>1.5），理论板数按龙胆苦苷峰计不低于3 000。色谱图见图1。

2015年版《中国药典》（一部）规定滇龙胆根及根茎为药用部位[2]，而大理州白族民间长期以滇龙胆全草入药，这可能是因为滇龙胆不同部位主要次生代谢产物存在差异，滇龙胆的主要活性成分裂环烯醚萜类物质在叶中合成并进行贮藏和分配[6]，且在花期中其叶、花中龙胆苦苷含量最高[14]。故本研究以开花期滇龙胆组培苗为试验材料，通过叶面喷施茉莉酸甲酯，考察以不同质量浓度处理不同时间后滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量的变化。研究结果表明，茉莉酸甲酯可显著提高滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量，随着质量浓度和作用时间的升高或延长，4种裂环烯醚萜类物质含量基本上呈先升后降的趋势，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯处理6 d后的效果最佳。同时还发现，在本试验条件下处理10 d后，叶中苦龙胆酯苷含量低于未处理叶，分析原因，这可能是由于茉莉酸甲酯促使植物产生了过多的植保素，对细胞自身的生长产生毒性，不仅抑制了细胞的生长，同时也抑制了代谢物的积累所致[15]。

据相关研究报道，经茉莉酸甲酯处理后，菜豆[16]、锦绣杜鹃[17]、苋菜芽[18]等植物中相关酶活性增强，次生代谢产物含量增加。本研究发现，喷施茉莉酸甲酯4 d后，叶中SOD、POD、CAT活性及MDA的含量较未处理叶均显著升高（P<0.05），基本上呈现先升后降的趋势，且在第4～8天活性增幅明显，与4种裂环烯醚萜类物质含量的变化趋势基本一致，这可能是由于POD、CAT等酶对外施茉莉酸甲酯产生胁迫的应激反应能在极短的时间内产生响应，通过反馈调节使植物体内自由基保持正常水平从而提高自身防御性，并迅速调整体内营养物质的运输和次生代谢的方向[8]。因此，可以认为茉莉酸甲酯处理滇龙胆叶片后，启动了滇龙胆的防御机制，导致这些防御反应的关键酶活性/含量升高，参与了裂环烯醚萜类物质的生物合成，最终促进了滇龙胆裂环烯醚萜类物质含量的升高。

综上所述，通过叶面喷施茉莉酸甲酯，可以显著提高滇龙胆叶中4种裂环烯醚萜类物质含量，其中以100 mg/L茉莉酸甲酯喷施6 d后效果最佳，该方法简单易行，可以在生产实践中加以应用，但有关茉莉酸甲酯促进滇龙胆中4种裂环烯醚萜类物质含量提高及防御酶的表达机制值得进一步深入研究。

参考文献

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