胶体金免疫层析法对非HIV感染肺隐球菌病患者疗效的评估价值

方素芳 张宏英 黄明翔

近年来，在全球范围内随着HIV感染、器官移植、糖皮质激素和免疫抑制剂等应用的增加，隐球菌病(cryptococcosis)的感染率、发病率、致死率均呈明显升高趋势[1-2]，对该病的诊断与治疗转归已成为临床重点关注的问题。

目前，诊断隐球菌病的主要方法为血清隐球菌荚膜抗原(CrAg)检测[3-4]，而其中的胶体金免疫层析技术(lateral flow assay，LFA)，因其较高的敏感度和特异度、操作简单、费用低廉等特点[5-6]，已成为临床医生检测血清CrAg的首选方法。但目前检测血清CrAg的研究主要针对HIV感染者，并认为HIV感染者的CrAg检测敏感度明显高于非HIV感染者，而将其用于非HIV感染者和肺隐球菌病治疗转归的研究均较少，且仅为治疗前、后或停药前某个时间点的数据说明，或仅以个别患者整个治疗过程中的随访评价得出结论，对临床非HIV感染者及疗效评估参考意义不大，更未见按照整个治疗过程时间轴进行随访的研究报道。本课题阐述非HIV感染者利用LFA检测CrAg对肺隐球菌病的诊断意义、影响因素及治疗后抗原动态变化，而本研究按照随访时间轴分析非HIV感染肺隐球菌病患者抗真菌治疗后LFA检测血清CrAg多个时间点的动态变化情况，评估血清CrAg水平变化能否作为肺隐球菌病患者疗效及停药的一项辅助指标，为临床诊治提供参考。

对象和方法

1.研究对象：选择2017年3—9月就诊于福建省福州肺科医院经HIV检测、病理活检、真菌培养等明确诊断[7]的非HIV感染的肺隐球菌病患者33例，纳入LFA检测血清CrAg阳性、自愿签署知情同意书、同意在我院接受规范治疗及定期随访的27例患者，其中男17例，女10例；年龄18～70岁，平均(47.4±8.3)岁。4例为体检时胸部CT检查发现肺部病灶，23例因临床症状行胸部CT检查而发现，其中咳嗽22例、咳痰20例、气喘7例、胸痛2例、发热2例、乏力1例；27例患者治疗前胸部CT表现均为单发或多发肺部孤立结节或肿块，斑片状实变浸润影，混合病变，伴随空洞征、支气管充气征、磨玻璃样影等改变。25例经病理组织学检查确诊，2例经支气管肺泡灌洗液培养出新型隐球菌确诊。本研究通过医院伦理委员会批准(批件编号：2017-005-01)并开展实施。

2.观察指标：收集抗真菌治疗前、后时间点LFA检测血清CrAg的定性及半定量测定、临床症状、胸部CT扫描等资料。收集时间点：开始治疗前的27～33 d、治疗后的27～33 d，以及治疗后的3、6、9、12、15、18个月的前后7 d内。LFA检测的动态监测标准：若患者在以上任一时间点定性检测结果为阴性即判定为CrAg阴转，无需再行半定量滴度测定及后续监测；若未阴转则继续监测。

3.LFA检测血清CrAg抗原：试剂购置于美国Immuno-Mycologies有限公司。常规无菌操作抽取静脉血约4 ml于无菌干燥采血管中，3000×g离心10 min取血清。(1)定性检测：将40 μl(1滴)样本稀释液(甘氨酸缓冲盐溶液，含有封闭剂和防腐剂)加入到无菌试管中，加入离心后的血清40 μl进行混合，将隐球菌抗原检测试纸条检测端插入混合样本液中，10 min后读取结果。结果判读：检测条带和对照条带同时出现为阳性；仅出现对照条带为阴性；若对照条带未出现，说明检测无效，应重新检测。(2)半定量滴度检测：取10个微离心管或试管放于试管架上，以1∶5作为初始稀释浓度，依次1∶2、1∶4、1∶16，直至稀释至1∶2560，并标号1～10。向1号试管中加入160 μl(4滴)样本稀释液，向2～10号试管中分别加入80 μl(2滴)滴定液(甘氨酸-盐酸缓冲液，含有防腐剂)，将40 μl样本加入1号试管并混匀，从1号试管中吸取80 μl样本混合转移到2号试管并混匀，依次进行稀释至10号试管。如果标本在1∶2560时仍呈阳性则需要继续稀释。将隐球菌抗原检测试纸条的白端(即检测端)分别浸入10个试管中，判读方法同定性检测，报告滴度为产生阳性结果的最高稀释度。

4.治疗及疗效判定标准：按照2010年美国感染性疾病协会(American Association of Infectious Diseases，IDSA)隐球菌病治疗指南[8]进行肺隐球菌病的治疗。参照中华人民共和国卫生行业标准工作组2012年制定的《侵袭性真菌感染质量控制》[9]标准中临床症状及胸部CT表现等判定临床疗效，分为完全缓解、部分缓解、稳定、进展/死亡。为进一步评价LFA检测血清CrAg水平变化情况对疗效的预测效果，本研究参照文献[9]中“以治疗3～12个月后患者完全缓解情况评价肺隐球菌病的疗效趋势”，分析治疗后3、6、9个月时LFA检测血清CrAg滴度改变情况，以评价是否对治疗6、9、12个月时的临床完全缓解具有预测能力。

5.统计学处理：采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析，非正态分布的计量资料采用中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]表示，计数资料以例(构成比或缓解率，%)]表示。以检测时间窗为横坐标，以半定量滴度值的自然对数转换值(ln抗原滴度)作为纵坐标，绘制治疗前高滴度组(滴度值≥160)与低滴度组(滴度值<160)抗原滴度值随时间变化的趋势线图。由于本研究资料属于重复测量设计，每期随访的患者例数会因抗原阴转而呈现逐渐减少的情况，无法使用重复测量方差分析的方法分析不同时期抗原滴度变化。

以治疗3、6、9个月后的血清CrAg滴度与开始治疗时的滴度比值为预测变量(自变量)，以6、9、12个月时患者完全缓解时的滴度值为结局变量(因变量)，绘制ROC曲线以评价血清CrAg变化情况对疗效的预测效果；使用约登指数寻找最佳改变截断点，并计算该点对应的敏感度与特异度。

结 果

1.临床治疗与疗效判定情况：27例患者使用不同药品治疗，其中21例采用氟康唑、3例采用伏立康唑、2例采用氟康唑+伏立康唑、1例采用伊曲康唑；24例采用单纯抗真菌药物治疗、3例采用手术+抗真菌药物联合治疗。治疗前有临床症状的23例患者，抗真菌治疗3个月后症状基本消失；而2例肺泡灌洗液培养阳性患者抗真菌药物治疗1个月后阴转。12例患者随访过程中胸部CT扫描显示病灶基本吸收，仅见少许索条状影，为完全缓解，分别为治疗1个月时1例(术后改变)、3个月时2例、6个月时8例、9个月时11例、12个月时12例；而其他14例在治疗12、15、18个月后胸部CT检查显示病灶呈渐进式吸收，仍可见斑点、斑片状影及实变影等病灶，为部分缓解；仅1例患者在治疗18个月时病灶未见明显变化，持续呈稳定状态，为疗效稳定。不同治疗时间点的抗原滴度水平及临床疗效判定情况见表1。

2.抗真菌治疗前后血清CrAg水平检测情况：27例患者治疗前CrAg检测均为阳性，半定量滴度值为5～5120，以治疗前CrAg滴度的中位数160为截断点，将27例患者分为14例高滴度组(滴度值≥160)与13例低滴度组(滴度值<160)。抗真菌治疗1、3、6、9、12、15、18个月后抗原检测定性阴转分别为1、5、9、11、14、15、18例，即总阴转例数为18例，半定量中位数测定结果见表1、图1，显示随着治疗时间延长，抗原半定量滴度总体呈逐渐下降趋势，仅1例患者因糖尿病并发肾病综合征在治疗1～6个月时呈现抗原滴度值水平无变化(持续为20)，而在9个月后突升为80，继而呈逐渐下降趋势，但临床症状及胸部CT扫描未见恶化。

3.治疗前的CrAg半定量滴度与临床完全缓解的相关分析：进行治疗前高滴度、低滴度组与临床疗效完全缓解的统计学分析，结果显示低滴度组中位缓解时间为6.0(2.1～9.9)个月，高滴度组因为大部分患者在随访时间点内未达到完全缓解，记为删失。至18个月随访期末，27例患者中随访12个月时累计有12例出现完全缓解(44.4%)，其中3例患者的滴度值为5、1例为10、2例为20、1例为40、2例为80、3例为160；故低滴度组12个月内的完全缓解累积缓解率(74.2%)高于高滴度组(21.4%)，两者比较差异有统计学意义(表2，图2)。

4.治疗后LFA检测血清CrAg变化情况与临床疗效相关分析：以治疗3、6、9个月后的血清CrAg滴度(分别以CrAg3、CrAg6、CrAg9表示)与开始治疗时的滴度(CrAg0)比值的百分比为预测变量(自变量)，以6、9、12个月时患者临床疗效为完全缓解时的滴度值为结局变量(因变量，分别以CR6、CR9、CR12表示)绘制ROC曲线，以评价LFA检测血清CrAg水平变化情况对疗效的预测效果(表3，图3)。

5.治疗后患者停药及CrAg滴度检测情况：所有患者治疗12个月后，22例停止抗真菌药物治疗，但仍有13例抗原检测阳性，滴度值为5～80；15个月后再有3例停止了抗真菌药物治疗，但仍有12例抗原检测阳性，滴度值为40；18个月后最后2例患者也停用了抗真菌药物，但仍有9例抗原检测阳性，滴度值为5～20。

共计27条线表示27例患者，但一些个体线条发生重合。横坐标为治疗时间窗，纵坐标为半定量滴度值的自然对数转换值(ln)；纵坐标刻度为0时表示抗原阴转(总阴转18例)

P=0.009为图中实线下方经Log-rank检验的检验值；横坐标为随访时间，纵坐标为各随访时期对应的累积缓解率

表1 27例患者不同治疗时间点的抗原滴度水平及临床疗效

注a：抗原滴度值水平

表2 高、低滴度组患者12个月完全缓解情况比较

表3 CrAg滴度的相对改变对临床完全缓解的预测水平

注a：治疗后6、9、12个月时患者完全缓解情况以二分类结果[缓解例数(缓解率，%)]表示；AUC为ROC曲线下面积；Z值为实线下面积与50%假设检验的检验值

横坐标为1—特异度(假阳性率)，纵坐标为敏感度(真阳性率)；CR为完全缓解；实线表示使用治疗3、6、9个月后的血清CrAg滴度与开始治疗时的滴度(CrAg0)比值预测CR时的ROC曲线，虚线表示随机猜测CR的参考线

讨 论

据一项国内多中心临床调查报道，肺隐球菌病的发病率仅次于曲霉菌和念珠菌感染，位于真菌性肺病第三位[10]，成为肺部真菌感染的常见疾病。其临床疗效的评估主要依据临床症状和体征、微生物学检查、胸部影像学表现、治疗时间等综合判断。但在血清CrAg检测开始应用于临床后不久，就有学者提出可以将CrAg定性检测作为监测隐球菌病病情、疗效及预后的依据[11-12]，且随着检测技术水平的提高，使得乳胶凝集试验、酶联免疫分析法、LFA法成为目前常用的CrAg检测方法，而LFA检测因其操作简便、费用较低等特点在临床中得到更广泛的应用。

本研究对LFA检测血清CrAg阳性的27例非HIV感染肺隐球菌病患者进行监测，结果显示，随着抗真菌治疗时间(1、3、6、9、12、15、18个月)的延长，血清CrAg的阳性结果及半定量滴度动态测定均呈逐渐下降趋势，从治疗前的半定量滴定值为5～5120，降低到治疗1个月后的滴定值为40、18个月后的滴定值为5；而且大部分患者在治疗过程中CrAg检测逐渐阴转，而未阴转的患者也处于5～20的低滴度值范围，提示CrAg水平监测有助于判定患者病情变化及抗真菌治疗后的药物疗效，对疗效观察评价有重要价值。国内张萍海等[13]通过乳胶凝集试验连续监测肺隐球菌病患者治疗前及治疗过程中血清抗原滴度，其结果显示CrAg滴度随肺部病灶的吸收呈逐渐下降趋势，与病程发展呈良好的正相关性；谢海花等[14]对22例LFA检测阳性隐球菌性脑膜炎患者进行治疗前后血清CrAg的滴度动态监测，结果显示治疗前后血清CrAg的滴度水平变化差异有统计学意义；李娟等[15]通过对168例脑膜炎患者在病程不同阶段的脑脊液进行CrAg乳胶凝集试验，显示脑脊液治疗前后其抗原滴度变化也存在差异。以上研究均进一步说明了LFA动态检测CrAg对疗效评估的意义。分析原因可能与抗真菌药物治疗后，患者体内大量隐球菌被抗真菌药物杀灭，死亡后的真菌细胞壁碎片被逐渐代谢出机体，释放入血的CrAg也逐渐减少有关，从而使患者病情好转，CrAg检测阴转或抗原滴度逐渐下降而处于低水平[16]。

根据IDSA隐球菌病治疗指南，建议对非HIV感染的肺隐球菌病患者抗真菌治疗疗程为6～12个月。本研究显示，随着治疗时间的延长，临床完全缓解率呈增加趋势、抗原滴定呈下降趋势，但在治疗12个月后临床完全缓解率保持不变(一直保持44.4%)。通过LFA检测治疗3、6、9个月后CrAg滴度与治疗前CrAg滴度百分比的比值对治疗 6、9、12个月后的临床完全缓解情况进行判定，结果显示CrAg滴度与临床完全缓解具有相关性(P值均<0.05)，特异度分别为75.0%、72.7%、83.3%、敏感度分别为89.5%、93.3、93.7%，说明治疗后定期随访CrAg滴度检测对其后继的疗效缓解及药物治疗疗程判定有临床意义，可以作为协助疗效判定的一项辅助检查手段。

临床缓解的疗效判定与病情轻重也呈密切相关，受到治疗前抗原半定量滴度高低的影响。Beyene等[17]对治疗3个月后的隐球菌病患者进行随访研究，结果显示氟康唑在治疗无症状隐球菌病患者比治疗隐球菌性脑膜炎发病患者及LFA可检测到血清CrAg滴度的患者治疗效果更好；并发现当LFA检测的血清CrAg滴度值≥1280时死亡率高达94%，而≤640时死亡率为38%，提示抗原滴度对隐球菌病患者的预后有明确影响，考虑机体抗原水平与病情轻重密切相关，抗原高滴度可认为机体隐球菌高负荷量、高定量，抗真菌治疗困难，预后不佳。

据Wake等[18]对19 233例HIV感染者应用LFA检测CrAg的调查报道，发现其血清CrAg半定量滴度值≥160是判定亚临床隐球菌性脑膜炎的最佳截点(敏感度为88.2%、特异度为82.1%)。本研究以滴度值中位数160为截点将患者分为低滴度组和高滴度组，结果显示低滴度组12个月的完全缓解率、累积缓解率均明显高于高滴度组，提示滴度水平与累积缓解率呈明显负相关。尽管本课题研究的是非HIV感染者，但以上结果显示，LFA检测血清CrAg半定量滴度值最佳截点在HIV感染者和非HIV感染隐球菌病患者中一致，可认为该最佳截点是评估病情轻重及临床缓解的截点，考虑与细菌负荷量及病情轻重有关。

参照2012年《侵袭性真菌感染质量控制》[9]标准，有研究报道，目前非HIV感染隐球菌病患者经过规范抗真菌治疗后大部分患者的治疗结局为完全缓解或部分缓解，稳定或进展较少，死亡患者极罕见[19-20]，说明该类患者临床疗效及预后良好。本研究患者治疗12个月后12例完全缓解、14例部分缓解、1例稳定，而随访过程中已按临床疗效停药的患者，即使部分患者呈现临床完全缓解，其抗原仍可显示阳性，并且半定量滴度值维持在5～20。尚鹏程等[21]在隐球菌性脑膜炎患者中进行治疗前后脑脊液和血清CrAg检测比较，认为动态检测CrAg水平可判定其疗效，并发现即使真菌培养阴转后，部分患者CrAg检测仍为阳性，但半定量滴度值仍维持在较低水平，并持续较长时间不变，与本研究一致。分析原因可能是死亡的隐球菌在脑脊液或血清中清除缓慢，仍可持续释放CrAg有关[22]，但滴度水平已很低，说明治疗有效。由于临床上停药时机是通过临床症状及胸部影像学表现来判定，故认为抗原滴度监测可以用来判断临床疗效，但不能作为停药指标。

既往由于HIV感染者易患隐球菌病，导致国内外关于LFA检测血清CrAg抗原在隐球菌病疗效方面的研究、隐球菌病的诊断及治疗共识均主要来源于HIV感染者的数据，使得本研究超过一半的参考文献是针对HIV感染者，对于本研究中非HIV感染者间的差异性分析需要今后更多的研究予以讨论。

综上，LFA检测血清CrAg是肺隐球菌病患者临床诊疗过程中一项重要检查，其阳性率及半定量滴度测定对病情缓解及疗效评估有明确指导意义，但由于抗原在机体内清除较缓慢，有可能较长时间显示检测阳性或处于较低水平状态，不能作为抗真菌停药治疗的指标。再者，由于项目涉及样本量较少，以及随访时间不长，使得结果存在一定局限性，有待下一步扩大样本量及随访时间进行更深入的研究。

志谢福建医科大学林征老师对本研究统计学方面进行了指导与修正。