水飞蓟宾抵抗阿霉素心脏毒性机制研究

郑 超,田作春,马继鹏,苏永超

(1海南省第三人民医院心胸外科,三亚 572000;2空军军医大学西京医院心血管外科;*通讯作者,E-mail:zhengchaosanya@126.com)

在过去的30年中,随着化疗、手术、放疗等抗癌技术和手段的不断进展,癌症死亡率已显著下降,同时癌症幸存者数量也迅速增加[1]。许多癌症幸存者在抗癌治疗后会并发心脏并发症,而且心脏并发症已成为该类人群继恶性肿瘤复发之后的第二大死亡原因[2]。抗癌治疗相关心脏毒副作用的典例是由蒽环类阿霉素(doxorubicin,DOX,又称多柔比星)引起的心肌损伤[3]。阿霉素在临床上广泛应用于治疗乳腺癌、淋巴瘤和白血病等多种肿瘤[4]。近几十年来国内外学者对于阿霉素心脏毒性的具体分子机制进行了深入探讨。研究证实,DOX可通过形成拓扑异构酶2β-DOX-DNA三元切割复合物诱导DNA双链断裂,导致心肌细胞凋亡[3]。此外,DOX还可选择性蓄积于线粒体中,增加线粒体铁水平并诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,诱发氧化应激损伤[5]。因此,寻找药物干预氧化应激损伤和细胞凋亡是改善阿霉素心脏毒性的潜在策略。

水飞蓟宾(silibinin,SIL)是从水飞蓟中提取出的一种多酚类黄酮抗氧化剂,具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物学作用,其生物学作用的发挥与线粒体密切相关[6,7]。以往研究表明,水飞蓟宾能够明显减轻阿霉素引起的心脏毒性,但其具体下游分子机制尚未完全阐明[8]。沉默信息调控因子3(silent information regulator 3,SIRT3)是线粒体内最主要的去乙酰化酶,可通过去乙酰化修饰作用参与调节线粒体氧化应激、能量代谢、线粒体途径凋亡等多种病理生理过程[9]。据此,我们推测水飞蓟宾缓解阿霉素心脏毒性的作用可能与SIRT3有关。本研究旨在探究水飞蓟宾是否通过激活SIRT3信号通路抑制细胞凋亡和氧化应激损伤进而缓解阿霉素心脏毒性。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和实验动物

水飞蓟宾(货号:02000585)购自Sigma公司(美国);DOX(货号:15007)购自Cayman公司(美国);二氢乙锭(Dihydroethidium,DHE)染料购自Invitrogen公司(美国);抗SIRT3、Ac-SOD2抗体购自Abcam公司(美国);抗SOD2抗体购自Santa-Cruz公司(美国);抗Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3和β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司(美国);羊抗兔、羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司(中国)。雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄),购自北京维通利华实验动物技术有限公司(中国),动物饲养于清洁级环境,自由进食进水。

1.2 实验分组及处理方式

将C57BL/6小鼠随机分为6组,即正常组(control组):腹腔注射生理盐水0.2 ml后每日灌胃0.2 ml生理盐水,灌胃5 d;单纯水飞蓟宾处理组(SIL组):腹腔注射生理盐水0.2 ml后每日仅灌胃给药水飞蓟宾(100 mg/kg),灌胃5 d;阿霉素处理组(DOX组):腹腔单次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml)后每日仅灌胃0.2 ml生理盐水,灌胃5 d;水飞蓟宾+阿霉素处理(SIL+DOX组):腹腔单次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml)后每日仅灌胃给药水飞蓟宾(100 mg/kg),灌胃5 d;3-TYP(SIRT3抑制剂)+水飞蓟宾+阿霉素(3-TYP+SIL+DOX)组:先腹腔注射3-TYP 50 mg/(kg·d) 3 d后,再通过腹腔单次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml),而后每日仅灌胃给药水飞蓟宾(100 mg/kg),灌胃5 d;3-TYP+阿霉素(3-TYP+DOX)组:先腹腔注射3-TYP 50 mg/(kg·d) 3 d后,再通过腹腔单次注射阿霉素(15 mg/kg,0.2 ml),而后每日仅灌胃0.2 ml生理盐水,灌胃5 d。

1.3 在体心脏血流动力检测

阿霉素处理5 d后,将小鼠用异氟醚(2%诱导,1.5%维持)麻醉,用微压力导管(Millar Instruments公司,型号SPR-839,1.4 F)从小鼠右颈动脉插管至左心室。使用Chart 5软件(AD Instruments公司)和Power Lab模数转换器记录左室收缩压最大上升速率(+dP/dt)和左室收缩压最大下降速率(-dP/dt)。具体操作流程参考文献[10]所述方法。

1.4 心肌组织HE染色

阿霉素处理5 d后,将小鼠颈椎脱臼处死,取心脏并于10%福尔马林中固定48 h。脱水至蜡包埋后将组织蜡块切成5 μm厚度组织切片。将组织切片进行苏木精-伊红(HE)染色观察心肌病理改变。

1.5 心肌组织凋亡检测

根据试剂盒说明书使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche公司)对心肌组织石蜡切片进行TUNEL染色。DAPI染色用于检测所有细胞核。凋亡率表示为TUNEL阳性细胞核数/总细胞核数×100%。

1.6 Western blotting检测Bax、cleaved Caspase-3、Bcl-2、SIRT3和Ac-SOD2的表达量

用含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂(Thermo Scientific公司)的RIPA缓冲液从心肌组织中提取蛋白质,通过SDS-PAGE凝胶电泳,湿转至PVDF膜,并将以下抗体在4 ℃孵育过夜:抗SIRT3(稀释比1 ∶1 000)、Ac-SOD2(稀释比1 ∶1 000)、SOD2(稀释比1 ∶500)、Bax(稀释比1 ∶1 000)、Bcl-2(稀释比1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(稀释比1 ∶1 000)和β-actin(稀释比1 ∶1 000)抗体。室温孵育羊抗兔、羊抗鼠二抗(稀释比1 ∶5 000)2 h。使用ECL化学发光底物试剂盒和BioRad成像系统检测各组蛋白表达情况。

1.7 心肌ROS产量测定

阿霉素处理5 d后,将液氮速冻的心脏用冰冻切片机切成10 μm厚切片。严格按照试剂盒说明书进行心肌冰冻切片DHE染色,用荧光显微镜拍照后用Image J软件分析各切片荧光强度。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 水飞蓟宾能改善阿霉素引起的心肌“空泡化”变性和心功能障碍

HE染色结果显示,control组小鼠心肌细胞未发生“空泡化”变性。单纯给予正常小鼠水飞蓟宾处理不引起心肌发生“空泡化”变性。而阿霉素处理5 d后,心肌组织出现明显“空泡化”变性。水飞蓟宾处理能够明显缓解阿霉素诱发的心肌“空泡化”变性(见图1)。Millar导管检测结果显示,单纯给予正常小鼠水飞蓟宾处理对心脏收缩和舒张功能无明显影响,表现为SIL组与control组相比,+dP/dt、-dP/dt均无明显差异(P>0.05)。阿霉素处理5 d后,小鼠心肌收缩和舒张功能均明显减弱,表现为与control组相比,+dP/dt和-dP/dt均明显降低(P<0.05)。而水飞蓟宾处理能够明显缓解阿霉素引起的心肌收缩和舒张功能障碍,表现为与DOX组相比,+dP/dt、-dP/dt均明显提高(P<0.05,见图2)。

图1 水飞蓟宾对阿霉素处理后小鼠心肌细胞“空泡化”变性的影响 (HE,×400)Figure 1 Effects of silibinin treatment on vacuolar degeneration in cardiomyocytes in doxorubicin-induced mice (HE,×400)

与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图2 水飞蓟宾对阿霉素处理后心脏收缩和舒张功能的影响 (n=6)Figure 2 Effects of silibinin treatment on cardiac systolic and diastolic function in doxorubicin-treated mice (n=6)

2.2 水飞蓟宾能降低阿霉素处理后心肌组织ROS产量

DHE染色结果显示,单纯给予正常小鼠水飞蓟宾处理对心肌组织ROS产量无明显影响(P>0.05)。阿霉素处理5 d后,心肌组织内ROS产量明显增加(P<0.05)。而水飞蓟宾可以明显降低阿霉素处理后心肌组织内ROS产量(P<0.05,见图3)。

与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图3 水飞蓟宾对阿霉素处理后小鼠心肌组织ROS产量的影响 (n=6)Figure 3 Effects of silibinin treatment on myocardial ROS production in doxorubicin-treated mice (n=6)

2.3 水飞蓟宾能抑制阿霉素处理后心肌细胞凋亡

TUNEL染色结果显示,单纯给予正常小鼠水飞蓟宾处理对心肌细胞凋亡率无明显影响(P>0.05)。阿霉素处理5 d后,心肌细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。而水飞蓟宾可以明显降低阿霉素处理后心肌细胞凋亡率(P<0.05,见图4)。此外,凋亡相关蛋白的表达情况显示,单纯给予正常小鼠水飞蓟宾处理对心肌组织Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的表达量无明显影响(P>0.05)。阿霉素处理5 d后,心肌组织Bax和cleaved Caspase-3的表达量明显增加,而Bcl-2表达量明显降低(P<0.05)。而水飞蓟宾可以明显降低阿霉素处理后心肌组织Bax和cleaved Caspase-3的表达量,提高Bcl-2表达量(P<0.05,见图5)。

图4 水飞蓟宾对阿霉素处理后心肌凋亡率的影响 (TUNEL,×400)Figure 4 Effects of silibinin treatment on myocardial apoptotic rate in doxorubicin-treated mice (TUNEL,×400)

1.control组;2.SIL组；3.DOX组；4.SIL+DOX组;与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图5 水飞蓟宾对阿霉素处理后心脏Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3表达情况的影响 (n=6)Figure 5 Effects of silibinin treatment on the expression levels of Bax, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in the heart of doxorubicin-treated mice (n=6)

2.4 水飞蓟宾能激活阿霉素处理后心肌SIRT3信号通路

单纯给予正常小鼠水飞蓟宾处理对心肌SIRT3表达量以及SOD2的乙酰化水平无明显影响(P>0.05)。阿霉素处理5 d后,心肌组织SIRT3表达量明显降低,而Ac-SOD2表达量明显增加(P<0.05)。而水飞蓟宾处理可以明显提高阿霉素处理后心肌SIRT3表达量,降低Ac-SOD2表达量(P<0.05,见图6)。

2.5 3-TYP明显削弱水飞蓟宾抵抗阿霉素心脏毒性保护作用

HE染色结果显示,与SIL+DOX组相比,3-TYP+SIL+DOX组心肌细胞“空泡化”变性明显加重(P<0.05,见图7)。Millar导管检测结果显示,与SIL+DOX组相比,3-TYP+SIL+DOX组心肌收缩和舒张功能明显降低,表现为+dP/dt和-dP/dt明显降低(P<0.05)。DHE染色结果显示,与SIL+DOX组相比,3-TYP+SIL+DOX组心肌ROS产量明显增高(P<0.05,见图8)。TUNEL染色和凋亡相关蛋白表达结果显示,与SIL+DOX组相比,3-TYP+SIL+DOX组心肌凋亡率、Bax和cleaved Caspase-3的表达量明显增加,而Bcl-2表达量明显降低(P<0.05,见图9,10)。与DOX组相比,3-TYP+DOX组小鼠的上述指标无明显差异(P>0.05)。

1.control组;2.SIL组；3.DOX组；4.SIL+DOX组;与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图6 水飞蓟宾对心肌组织SIRT3信号通路的影响 (n=6)Figure 6 Effect of silibinin treatment on SIRT3 signaling pathway in heart tissues (n=6)

3 讨论

阿霉素是临床上广泛应用的一种强效广谱化疗药物,可用于治疗多种癌症[4]。然而,阿霉素超过一定剂量后即可引发心脏毒性,可导致化疗患者发生充血性心衰甚至猝死[11]。阿霉素心脏毒性已经成为限制阿霉素临床应用的最主要因素。迄今为止,FDA唯一批准的用于蒽环类化疗心脏保护的药物是右丙亚胺,右丙亚胺可通过诱导拓扑异构酶2β的蛋白酶体降解以及降低线粒体铁离子水平来发挥心肌保护作用[2,5]。然而,由于右丙亚胺可能会损害蒽环类化疗药物的抗肿瘤活性[2],因此亟需寻找新的心肌保护药物改善化疗患者心脏并发症。

水飞蓟宾是从水飞蓟中提取出的一种有效活性成分。越来越多研究[6-8,12]表明,水飞蓟宾能够有效改善多种心血管疾病。Muthumani等[6]证实,水飞蓟宾可通过减轻氧化应激损伤和改善血脂代谢异常缓解亚砷酸钠诱导的心脏毒性。Anestopoulos等[12]发现,水飞蓟宾可通过调解ERK1/2和Akt信号通路激活抗氧化机制减弱去氧肾上腺素诱导的心肌细胞肥大。Zhou等[7]证实,水飞蓟宾可通过抑制caspase途径和下调p53表达保护心肌细胞免受异丙肾上腺素诱导的DNA损伤。此外,水飞蓟宾能够改善阿霉素引起的大鼠心脏损伤[8],但具体作用机制仍需进一步探究。值得注意的是,充分证据显示,水飞蓟宾具有抗氧化和抗凋亡生物活性。Song等[13]发现,水飞蓟宾可通过抑制β淀粉样蛋白诱导的阿尔兹海默病大鼠炎症反应、氧化应激损伤和调节自噬,从而缓解阿尔兹海默病大鼠记忆缺陷。Jiang等[14]发现,水飞蓟宾可明显抑制过氧化氢诱导的PC12细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。Bouderba等[15]证实,水飞蓟宾治疗可缓解代谢综合征大鼠代谢功能障碍,降低胰岛素抵抗,并提高抗氧化能力。Zhou等[7]证实,水飞蓟宾可抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡。在该研究中,我们发现,水飞蓟宾可明显减轻阿霉素引起的心肌“空泡化”变性,改善阿霉素对小鼠心脏收缩和舒张功能的损害。此外,水飞蓟宾还可有效抑制阿霉素引起的ROS产量,降低心肌细胞凋亡率,降低Bax表达,抑制Caspase-3的激活,提高Bcl-2的表达。以上结果提示,水飞蓟宾可能通过抗氧化和抗凋亡发挥抗阿霉素心脏毒性作用。

SIRT3是线粒体内最主要的去乙酰化酶,近年来SIRT3的心肌保护作用越来越受到关注。充分证据显示,SIRT3在调节氧化应激状态和细胞凋亡方面也发挥了关键作用。SIRT3一方面可通过调节电子传递链关键蛋白的乙酰化水平,稳定氧化呼吸链从而从源头上减少ROS产量;另一方面,SIRT3还可通过提高抗氧化酶如SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的抗氧化应激能力,清除过量产生的ROS,抑制氧化应激损伤[16]。此外,SIRT3可抑制Bax的线粒体转位,从而抑制心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡[17]。激活SIRT3信号通路已被证实能有效缓解心肌缺血再灌注损伤[17]、心梗[18]、心肌纤维化[19]、压力负荷引起的心肌肥厚[20]等心血管疾病。特别值得注意的是,SIRT3已经成为治疗阿霉素心脏毒性的重要作用靶点。多项研究证实,DOX处理后小鼠和大鼠心脏中SIRT3的表达量明显降低,而线粒体蛋白的乙酰化水平明显增高[21-23]。上调SIRT3的表达量或活性是缓解阿霉素心脏毒性的有效策略。Cheung等[22]发现,DOX和白藜芦醇共处理可以明显缓解DOX对SIRT3表达的抑制,减轻了H9c2细胞和小鼠心脏中蛋白质乙酰化水平和线粒体ROS产量。而敲除SIRT3基因后,白藜芦醇的保护作用明显减弱,提示SIRT3是介导白藜芦醇抗阿霉素心脏毒性的关键靶点。DOX处理能明显降低新生大鼠心肌细胞线粒体膜电位并导致线粒体DNA损伤,而过表达SIRT3可明显减弱DOX诱发的线粒体损伤[21]。Pillai等[24]证实,和厚朴酚可通过激活SIRT3信号通路,抑制阿霉素诱导的大鼠新生心肌细胞产生ROS、线粒体损伤和细胞凋亡,促进线粒体融合,从而缓解阿霉素诱导的心肌损伤。Coelho等[25]发现,小檗碱预处理能够上调DOX处理后SIRT3的蛋白表达水平并抑制DOX诱导的Caspase-9和Caspase-3样激活。在该研究中,我们发现,阿霉素处理后小鼠心肌组织SIRT3表达量和活性均明显受损,伴随ROS产量和心肌细胞凋亡率明显增加。而水飞蓟宾共处理后SIRT3表达量和活性均明显增加,并可抑制阿霉素处理后心肌组织内ROS产量和凋亡情况。阻断SIRT3信号通路后,水飞蓟宾的上述心肌保护作用明显减弱。

与DOX组比较,#P<0.05;与SIL+DOX组比较,*P<0.05图8 水飞蓟宾和3-TYP对阿霉素处理后心脏收缩舒张功能以及ROS产量的影响 (n=6)Figure 8 Effects of silibinin and 3-TYP on cardiac systolic and diastolic function and ROS production in doxorubicin-treated mice (n=6)

图9 水飞蓟宾和3-TYP对阿霉素处理后心肌凋亡率的影响 (TUNEL,×400)Figure 9 Effects of silibinin and 3-TYP on the apoptosis in the hearts of doxorubicin-treated mice (TUNEL,×400)

1.DOX组；2.SIL+DOX组；3.3-TYP+SIL+DOX组；4.3-TYP+DOX组;与DOX组比较,#P<0.05;与SIL+DOX组比较,*P<0.05图10 水飞蓟宾和3-TYP对阿霉素处理后Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3表达情况的影响 (n=6)Figure 10 Effects of silibinin and 3-TYP on the expression of Bax, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in the hearts of doxorubicin-treated mice (n=6)

综上所述,该研究证实水飞蓟宾可通过抑制氧化应激损伤和心肌凋亡缓解阿霉素心脏毒性,且其保护作用主要由SIRT3信号介导。该研究为进一步探究水飞蓟宾缓解阿霉素心脏毒性的分子机制以及临床应用奠定了的理论基础。