草莓果实中FaPP2CX1基因克隆与表达分析

陈新红，沈元月

(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

草莓属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)，其果实酸甜可口，富含维生素、蛋白质、人体必需的矿物质和微量元素，深受广大消费者的喜爱，被誉为“水果皇后”[1-3]。草莓被认为是研究非呼吸跃变型果实成熟的模式材料[4-5]，并建立ABA核心信号转导“ABA-PYR/PYL/RCAR-PP2C-SnRK2”调控草莓果实成熟的分子机制：ABA缺乏时，PYR/PYL/RCAR受体蛋白以二聚体形式存在，不能与PP2Cs相互作用，PP2C蛋白磷酸酶结合下游的SnRK2蛋白激酶，使SnRK2去磷酸化从而失活；ABA增多时，ABA与PYR/PYL/RCAR受体蛋白结合，改变受体的构型，进而与PP2Cs相互作用，使SnRK2s得到释放，恢复自我磷酸化与蛋白磷酸化活性，释放的SnRK2s激活下游转录因子、ABA响应元件结合蛋白(AREBs)和ABA响应元件结合因子(ABFs)等靶目标[6-8]。PP2C是ABA信号转导的核心组分，水稻和拟南芥的PP2C家族成员分别有78、80个[9]。拟南芥中ABI1、ABI2、AHG1、AHG3/AtPP2C-A、HAB1及HAB2等PP2C类蛋白属于A亚族，对ABA信号起负调控作用[10]，这一点在其他作物得到验证[11-14]。

在栽培草莓转录组数据[15]中检测到12个PP2C家族基因，其中发现一个草莓属中独有的转录本，并与二倍体草莓转录变体X1(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的同源性最高，并且含有PP2C保守结构域，故将此基因命名为PP2CX1。本研究通过基因克隆、生物信息学及基因在草莓果实不同发育时期的表达量进行分析，初步探究FaPP2CX1在草莓果实成熟调控中的作用。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本试验使用北京农学院东大地温室栽培的八倍体草莓品种‘甜查理’。温度17～26 ℃、相对湿度70%～90%、光照14 h、黑暗10 h。选取30个草莓单株的90朵花，并对其进行花期标记。在果实发育的五个时期进行取样：大绿期(花后16 d)、白果期(花后22 d)、始红期(花后24 d)、片红期(花后26 d)和全红期(花后28 d)，每个时期选取10个大小一致的果实样本，去瘦果(种子)，切成0.5～0.8 cm3的立方体，液氮速冻，置于-80 ℃冰箱待用。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 每个阶段的3个果实用于RNA提取和cDNA合成。使用OMEGA RNA提取试剂盒，从0.5 g草莓花托中提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳、A260∶A230和A260∶A280比率分析RNA的纯度和完整性。使用全式金反转录试剂盒逆转录300 ng总RNA以合成cDNA。

1.2.2FaPP2CX1基因的克隆与测序 根据二倍体草莓转录变体X1(NCBI Reference Sequence:XM-011465736.1)的编码序列，设计扩增引物，上游引物：5′-ATGCTATCACCGGTCGTCGA-3′；下游引物：5′-TTAGTTTCTTTGAGCTCTCAT-3′。反应体系50 μL，其中ddH2O 31.5 μL，5×Q5 buffer 10 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，上游引物 2.5 μL，下游引物 2.5 μL，cDNA模板 2 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerases 0.5 μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s ；65 ℃退火30 s；72 ℃延伸120 s；共33个循环；72 ℃延伸2 min；4 ℃保存。将得到的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，然后将目的条带进行胶回收纯化。将回收的目的条带与克隆载体pEASY-Blunt Simple连接，转化大肠杆菌感受态(E.coliDH5α)，挑取单菌落进行PCR，条带正确的单菌落送生工生物(上海)有限公司测序，并将测序结果与二倍体草莓序列(NCBI Reference Sequence:XM-011465736.1)进行比对。

1.2.3FaPP2CX1基因生物信息学分析 利用NCBI CD-Search分析FaPP2CX1的功能保守结构域；利用ExPASy网站预测蛋白的分子量、等电点、稳定指数以及亲疏水性等信息；利用NCBI BLAST(Protein)功能，筛选出同源性较高的物种，构建进化树(MEGA 5.10)，分析亲缘关系。

1.2.4FaPP2CX1表达量分析 利用Primer 5软件设计荧光引物，上游引物序列：5′-TCTACCGTCACTCAGCAACC-3′，下游引物序列：5′-AAACCCTTCGGGAACATC-3′。以草莓Actin为内参基因，上游引物序列：5′-TGCATATATCAAGCAACTTTACACTGA-3′，下游引物序列：5′-ATAGCTGAGATGGATCTTCCTGT-3′。以草莓果实总RNA反转的cDNA为模板，使用Trans Start Top Green qPCR Super Mix 试剂盒在Light Cycler 96实时PCR系统上进行qPCR。10 μL的反应含有2TransStrat top Green qPCR SuperMix，0.25 μL正向特异性引物(10 μmol/L)，0.25 μL反向特异性引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板和2.5 μL双蒸水。通过LC96软件分析基因相对表达量，试验重复3次。利用SPSS 12.0软件进行统计分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 基因克隆与测序

以八倍体草莓‘甜查理’总RNA逆转录的cDNA为模板，克隆出FaPP2CX1基因，全长为3 765 bp，编码1 254个氨基酸，与二倍体草莓转录变体X1(NCBI Reference Sequence:XM-011465736.1)相差13个碱基(图1，方块标记部分)，6个氨基酸，突变无终止密码子。

图1 二倍体与八倍体草莓PP2CX1基因序列对比Fig.1 Comparison of PP2CX1 gene sequence between diploid and octoploid strawberry

2.2 FaPP2CX1生物信息学分析

利用NCBI CD-Search分析出FaPP2CX1的功能保守结构域有四个(图2)，分别是真核丝氨酸苏氨酸激酶的N-末端(STK_N)结构域、富亮氨酸重复蛋白(LRR)结构域、核苷酸结合(NB-ARC)结构域和蛋白磷酸酶(PP2C)结构域；经NCBI数据库蛋白序列比对，选择与FaPP2CX1同源性较高的物种，通过MEGA 5.10软件构建系统进化树，结果表明草莓属植物与其他属植物相分离。其中八倍体FragariaananassaFaPP2CX1与二倍体Fragariavesca(GenBank，XP_011464038.1)属于同一分支，同源性为100%(图3)；而在另两个分支中，FaPP2CX1与Prunusavium(GenBank，XP_021817227.1)、Rosachinensis(GenBank，XP_024193972.1)蛋白序列的同源性分别为72.88%、81.17%，但是Prunusavium(GenBank，XP_021817227.1)中没有STK结构域、LRR结构域和NB-ARC结构域；Rosachinensis(GenBank，XP_024193972.1)中没有STK结构域和PP2C结构域，这些结果表明FaPP2CX1是草莓属中独有的基因；ExPASy网站预测到该蛋白有1 254个氨基酸，分子量为140.17 kD、等电点是6.46、不稳定指数(II)

图2 FaPP2CX1的保守结构域Fig.2 Conserved domain of FaPP2CX1

图3 FaPP2CX1的系统进化树分析Fig.3 System phylogenetic tree analysis of FaPP2CX1

计算为47.24，将蛋白分类为不稳定蛋白，亲水性的平均值(GRAVY)为-0.217，表明此蛋白为亲水蛋白。

2.3 FaPP2CX1表达量分析

以大绿期、白果期、始红期、片红期和全红期五个时期的cDNA为模板，进行荧光定量分析。从大绿期开始，FaPP2CX1的表达量逐渐降低，始红期到达最低值；而后随着草莓果实着色加深，表达量迅速上升，并在果实成熟(即全红期)达到最高，暗示着FaPP2CX1可能参与草莓果实的成熟调控(图4)。

图4 不同时期FaPP2CX1的表达量Fig.4 Expression of FaPP2CX1 in different periods

3 讨 论

关于ABA信号转导的主要研究成果是ABA-PYR/PYL/RCAR-PP2C-SnRK2途径，PP2C作为核心组分在ABA信号转导中起负调控作用。在拟南芥中，PP2C蛋白磷酸酶A亚族负调控ABA信号；在草莓中，2C型蛋白磷酸酶FaABI1基因表达量随着果实的成熟而下降，作为负调控因子参与草莓果实成熟的调控[7]，这与本研究中FaPP2CX1基因前期的表达量下降(大绿期、白果期、始红期)是一致的，推测果实成熟前期该基因的PP2C蛋白磷酸酶结构域主导负调控草莓果实的发育。氨基酸序列同源比对发现FaPP2CX1与抗病基因有较高的相似度，且LRR是生物体中抗病基因具有的结构域[16]，推测与该基因抗病有关。另外，LRR结构域可与ABA结合并正调控草莓的成熟[17]，这与草莓果实成熟后期(始红期、片红期和全红期)表达量迅速上升相符合，说明草莓果实成熟后期LRR结构域可能起主导作用。有研究发现BRI1的胞外LRR结构能感知BR[18]，BR结合BRI1后，BRI1的激酶区构象改变，C端延伸区(6个丝氨酸和2个苏氨酸)被反向磷酸化，BRI1自我抑制解除，进而传递出BR信号[19]，推测FaPP2CX1的LRR结构域可能与BR结合，激活N端STK结构域的激酶活性，使其与C端的PP2C磷酸酶结构域发生互作，从而调控草莓果实的成熟。