母马大、小卵泡的卵泡液代谢组学分析及其对卵泡发育的影响

邢亚楠，张 勇，黄娇娇，董焕声，潘庆杰

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

对于母马来说，繁殖特点为妊娠期长，性成熟晚，体成熟晚,发情持续时间长，以上因素决定了马产业的周期长、受胎率低。促进母马多排卵或者保证卵子质量是保证高效率的繁殖方法。卵泡液是卵母细胞生存的微环境，卵母细胞成熟在卵泡液中可能涉及一些物种特异性机制，可能与马卵泡液中所含的必需因子有关，已经有报道在母马中研究了一些可溶性因子[1]。

卵泡液(Follicular Fluid) 主要包括穿过血液卵泡屏障的血浆成分和从颗粒细胞分泌的物质（如类固醇、氨基酸和其他核苷酸等），其为卵母细胞的成熟和随后的发育提供了重要的生长环境，也是卵母细胞与周围细胞进行物质交换和能量代谢的场所，卵泡液代谢物组成和变化间接反映了卵母细胞生长发育及成熟过程[2]。因此，卵泡液的组成成分显示了卵巢卵泡生长的情况，这些物质能更好地反映卵巢卵泡发育和卵母细胞质量[3]。大量研究已经检测了卵泡液中特定激素和生长因子的水平，并且已经使用HPLC 技术在人类[4]和动物[5]中鉴定了卵泡液中的氨基酸成分。此外，还确定了卵泡液的离子成分[6-7]以及葡萄糖、乳酸盐、尿素和脂质的存在。但只有少数研究描述了卵巢周期中卵泡液成分的变化[8]。卵泡液成分的研究可能有助于理解卵泡分化和发育中涉及的机制，所有这些因素的存在与卵巢细胞的代谢活动有关，并反映了卵泡的生理状态。然而，卵巢功能受这些因素的影响仍然未知。本文借助卵泡液代谢组学，得到直径不同的卵泡液差异代谢物，试从卵泡液代谢组学层面探索卵泡直径相关性生殖功能的实质。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择8 头营养中等、健康的圈养即墨母马，年龄均为3～5 岁。在3—4 月发情季节，屠宰后取得卵巢。装入有37℃预热的生理盐水和双抗混合液的保温瓶中并带回实验室。从屠宰场送回到实验室大约3 h。

1.2 实验仪器和试剂 Triple TOF 5600+质谱仪（AB SCIEX）；Agilent 1290 Infinity LC 超高压液相色谱仪（Agilent）；低温高速离心机 (Eppendorf 5430R)；色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 µm，2.1 mm×100 mm column 乙腈(Merck，1499230-935)；乙酸铵(Sigma，70221) ；PBS 缓冲液（Hyclone，pH=7.4）。

1.3 卵泡挑选和卵泡液的收集方法 先用75%酒精轻轻擦洗卵巢表面，避免污染，然后放入37℃含双抗的生理盐水中，用灭菌剪刀剪掉母马卵巢周围的结缔组织，选择外观明亮、呈淡粉色且无黄体的健康卵巢，用游标卡尺测量卵泡直径，淘汰形状不规则或者有破裂的卵泡。在无菌试验中，用10 mL 的无菌注射器抽取卵泡液，按照实验需求的直径分别吸到无菌15 mL 离心管中，在1 200 r/min 的离心力下离心5 min 后，吸取澄清的上清液，分成等分试样放入冻存管中并放入超低温冰箱-80℃冷冻，将第1 次吸出的上清卵泡液送去公司检测差异代谢物，剩下的样品冷冻保存，进行下一步分析。

1.4 样本信息 本实验选取8 匹母马的健康卵巢，选取直径为45～60 mm 的卵泡为一组（大卵泡组）；直径为20～30 mm 的卵泡为一组（小卵泡组），样本信息见表1。

表1 2 组间的大小卵泡直径

1.5 样品预处理和仪器校正 把等体积的甲醇和乙腈充分混合，再取样品100 μL 后加入400 μL 的甲醇-乙腈混合液中，涡旋混合均匀，在-20℃下放置60 min；在4℃温度下，14 000 ×g 水平离心20 min，提取上清液，管底的沉淀物质弃去；样品预处理步骤完成后，在放入高效液相质谱仪器分析前，对仪器进行校正。用移液枪吸取乙腈和水各100 μL，然后充分混匀，在4℃下14 000 ×g 水平离心15 min 后，小心抽取上清混合液放入色谱仪中进行检测。

1.6 液相色谱分析方法 液相：Agilent 1290 Infinity LC 超高压液相色谱仪（Agilent）；色谱柱：Waters,ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 µm,2.1 mm×100 mm column；柱温：25℃；流速：0.3 mL/min；进样量：正离子、负离子模式下都是2 μL；流动相：水+25 mol/L乙酸铵+25 mmol/L 氨（A）水，乙腈（B）；梯度：梯度洗脱程序见表2。

表2 超高效液相色谱仪的浓度洗脱梯度表

1.7 统计分析 用高效液相色谱本身自带的处理软件Data Analysis 进行数据整合，对图谱峰进行校正。用Proteo Wizard 软件将校正数据转换为mzXML 格式。应用软件SIMCA-P14.1（Umetrics，Umea，Sweden）将具有相似特征的数据进行归类，然后再使用降维法进行检验，主要是采用主成分分析数据处理。单维数据统计方法包括t-test 检测和变异倍数解析，应用R 软件绘制图谱。

2 结果

2.1 实验质量控制 为避免仪器检测造成实验结果不准确，对样本采用随机顺序进行研究。样本混合中插入QC 样品，用于监测和评价仪器的稳定性及实验数据的可信度。采用QC 样本谱图比对和PCA 分析对本项目的系统稳定性进行分析评价。将QC 样本UHPLC-Q-TOFMS 总离子流图，进行谱图重叠比较，结果表明各色谱峰的峰度和保留的时间基本重叠一致，说明在整个实验过程中由仪器引起的误差较小（图1）。

图1 QC 样品正（A）、负离子（B）模式TIC 重叠图谱

图2 正(A)、负(B)离子模式下大、小卵泡液得分图

2.2 正、负离子模式下大、小卵泡液PCA 得分图 PCA得分图显示，正离子模式下的大、小卵泡组在PC1 维度上没有很好分离，并且大、小卵泡的个体分离非常大（图2-A）；负离子模式下的大、小卵泡2 组在PC1 维度上有较好分离，且相对于大卵泡样本，小卵泡样本聚合的程度较好，大卵泡的分散程度太高（图2-B）。

2.3 高效液相色谱下大、小卵泡液代谢物的差异 表3显示，来自16 个卵泡（大小卵泡各8 个）和所研究的相匹配的定性定量代谢物，鉴于卵泡液是复杂的生物流体，可以看到一些类固醇激素、脂质和糖类等。

表3 差异物质

2.4 大、小卵泡液代谢物的比较 高效液相色谱定性定量测量对应于上调代谢物睾酮、1-棕榈酰溶血磷脂酸、β-硫酸雌醇、硫酸雌酮，下调物硫酸吲哚酚、木子塘、水苏糖和3-脲基丙酸酯。如表3 所示，大卵泡中β-硫酸雌醇、硫酸雌酮含量较小卵泡高（FC=4.48,P＜0.05，FC=12.30,P＜0.05），大卵泡硫酸吲哚酚和3-脲基丙酸酯含量较小卵泡低（FC=0.70,P＜0.05，FC=0.54,P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 上调代谢物对卵泡发育的影响 本研究表明，在上调的4 种代谢物中，睾酮、β-硫酸雌醇和硫酸雌酮是类固醇激素，1-棕榈酰溶血磷脂酸是磷脂酸，而这4 种代谢物在母马大卵泡中含量高。1-棕榈酰溶血磷脂酸参与生物体内许多重要的生理活动，包括细胞的增殖、分化及细胞因子的分泌等[9-11]。本研究中，溶血性磷酸酯在大卵泡中含量高，说明此物质对卵母细胞的发育有影响，与Bettegowda 等[12]研究得出的溶血性磷酸酯可以改善卵母细胞功能的结论一致。

众所周知，性激素对于女性的生殖发育来说非常重要，雄烯二酮和硫酸雌酮都是合成雌激素的前体[13-14]，雌二醇通过促进卵泡颗粒细胞生长而促进卵泡发育[15-16]。大卵泡中雄烯二酮、硫酸雌酮和硫酸雌醇浓度最高，但在小卵泡中，类固醇激素都是下调的，由此可以推断，类固醇激素是调节卵泡发育和卵母细胞成熟的关键物质。

3.2 下调代谢物对卵泡发育的影响 下调的4 种代谢物包含木子塘、水苏糖、3-脲基丙酸酯和硫酸吲哚酚，硫酸吲哚酚是一种蛋白质类毒素，木子塘和水苏糖都属于糖类，3-脲基丙酸酯是一种核苷酸类代谢物，而这4 种代谢物在母马大卵泡中含量低。本研究中，随着卵泡直径的不断增大，卵泡内糖含量减少，并且大卵泡内糖含量大约是小卵泡的1/3，这一结果与Gérard 等[17]在母马实验中得到的结论一致，即在母体的排卵前成熟过程中卵泡内含糖量降低。考虑到大、小卵泡直径相差比较大，可以认为这种卵泡内葡萄糖的消耗是由进入卵泡中的水稀释造成的。或者也可以认为，大卵泡由于一些生理问题或外界因素（即将要闭锁），次级卵泡需要更多的能量发育成为优势卵泡。

有关研究证明，棉子塘和水苏糖降低了猪对饲粮氮和氨基酸的消化率，说明水苏糖和棉子糖的抗营养性主要表现在营养物质消化率上[18]。以上研究结果都与本实验结果相符，进一步解释了可能在母马中大卵泡液里糖类含量少的原因。在小卵泡中3-脲基丙酸酯浓度较高，鉴于3-脲基丙酸酯会引起细胞内活性氧物质的积累，推测此物质会抑制小卵泡继续发育，通过抑制能量代谢来间接控制卵母细胞成熟发育[19]。硫酸吲哚酚多与肾病相关[20]，当硫酸吲哚酚在正常人肾脏体内聚集，不能被及时排出，就会与蛋白结合形成蛋白毒素[21]。硫酸吲哚酚具有很多毒性，如加速肾脏硬化[22]、促进肾脏间纤维化[23]；也有研究表明硫酸吲哚酚与心血管疾病有关[24]。小卵泡中的硫酸吲哚酚含量高，有可能会从肾脏中渗透入卵泡液中，间接抑制了卵母细胞的发育成熟，也有可能是由于实验样本少，且会出现疾病母马。

本研究中，卵泡液中上调的物质涉及到3 种常见的类固醇激素和1 种磷脂，都有利于卵泡发育，进而间接促进卵母细胞成熟；而小卵泡中的代谢物对于卵母细胞基本上都是有抑制作用或毒害作用，不利于细胞生长发育。研究发现的差异性代谢物与马的生殖功能密切相关，影响马卵母细胞的发育、成熟、衰老，通过数据库查找卵泡差异代谢物的生物学功能及其参与的相关代谢通路，对马的大小卵泡中代谢物进行分析，发现了一些马卵泡发育和卵母细胞成熟或与其相关的代谢物，为今后提高马卵母细胞体外培养成熟率提供了依据。但研究大小卵泡的筛选标准缺乏客观的观察指标，而且由于卵泡液检测费用较高，获取的样本量少，缺乏大样本、多中心的研究，需要进一步研究。此外，本研究所筛选的差异性代谢物只是初步的筛选，代谢物具体的影响机制仍需要进一步研究。实验中无法做到单卵泡单针取卵，混合后的卵泡液是否会影响结果不得而知，仍需进一步探索新的方法，以提供全面可靠的依据。