山羊环状RNA circ_ZCCHC24 表达载体的构建及对颗粒细胞增殖的影响

2019-10-17陈明新

中国畜牧杂志 2019年10期

陶虎，张元，杨娟，张年，熊琪，刘洋，陈明新*

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；2.黄冈市农业科学院，湖北黄冈 438000）

羊属于少胎动物，母羊的繁殖力是决定养羊产业效益的最重要因素之一，提高母羊繁殖性能在育种工作中尤为重要[1]。我国山羊产业规模化和集约化程度相对较低，关于山羊繁殖性状遗传规律的研究有限，限制了山羊繁殖性状的选育提高。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类新型的内源性非编码RNA，它是在mRNA 前体（pre-mRNA）剪切过程中，外显子和（或）内含子以反向剪切形式连接的磷脂键，最终以共价闭合形态存在的环状RNA 分子[2-3]。circRNA具有环状稳定结构和组织表达特异性等特性[4-5]。目前，circRNA 的研究多集中于医学方面[6-7]，在家畜中研究较少，尤其在家畜繁殖性状中的研究还处于初始阶段。circRNA 主要通过与RNA 结合蛋白结合形成RNA-蛋白复合物，调控线性亲本基因的转录[8]；吸附miRNA调控基因的表达[2]。近年来，有研究发现circRNA 能够编码蛋白质，发挥生物学功能[9-10]。circRNA 调控卵泡发育的研究较为有限。有报道显示，circRNA-3175 通过调控TESTIN基因抑制奶山羊子宫内膜上皮细胞凋亡[11]。Capel 等[12]在小鼠精子决定基因SRY中发现了circRNA，并且SRY 也被证实可以吸附miR-138 从而发挥“miRNA 海绵”作用[13]。circRNA 具有重要的调控功能，因此circRNA 已成为新的非编码RNA 研究领域的热点。近年来对于circRNA 的研究日益增多，但对circ_ZCCHC24在山羊卵泡中的作用机制还未见详细研究。本研究以前期通过转录组测序分析得到的circ_ZCCHC24为研究对象，通过构建其真核表达载体，研究circ_ZCCHC24对山羊卵泡颗粒细胞增殖的调控作用，为揭示circ_ZCCHC24对山羊卵泡发育的遗传调控机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料自在湖北省农业科学院种羊场和湖北波尔山羊保种场选择18 月龄的成年母羊，采集山羊血液和卵巢样品。样品采用全血基因组DNA 提取试剂盒（百泰克公司）进行提取，-20℃保存备用；聚合酶I-5™2×High-Fidelity Master Mix 购自北京擎科公司。Ecos 感受态细胞和pcDNA3.1 表达载体由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存；质粒pMD18-T Vector 购自宝生物工程（大连）有限公司；环状RNA 表达载体pCD2.1-ciR 购自吉赛生物；限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ、T4 DNA 连接酶及高保真DNA 聚合酶购自NEB 公司；MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物公司；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Omega 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 环状RNA circ_ZCCHC24 编码序列的扩增根据前期转录组测序结果分析得到circ_ZCCHC24 的全长序列，设计合成引物对pc-circ_ZCCHC24-PF/PR，并在上下游引物5′端分别引入了KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以山羊DNA 为模板，利用上述引物进行PCR扩增，预期片断长度为2 045 bp。PCR 扩增反应程序：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，60℃变性10 s，72℃变性20 s，40 个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR 仪为Mini CyclerTM 基因扩增仪。琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，利用DNA 快速纯化回收试剂盒回收目的片段，具体操作按产品说明书进行。

1.2.2 表达载体的构建与鉴定将circ_ZCCHC24 扩增胶回收片段和pCD2.1-ciR 载体质粒经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切并切胶回收。二者回收产物加入T4 连接酶和Buffer，16℃连接2 h，连接反应体系：2 种胶回收产物各4 μL、1 μL 10×Buffer、1 μL T4 连接酶。连接体系加入50 mL Ecos 感受态细胞，均匀涂布于含Amp（氨苄）的LB 固体培养基上，于37℃培养箱中过夜。利用含有Amp 的LB 培养基筛选阳性克隆。将阳性菌液送北京奥科生物科技公司测序验证，提取重组载体质粒备用。

1.2.3 细胞培养及circ_ZCCHC24 表达质粒转染中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存，细胞培养基为DMEM-F12 中加入10%的胎牛血清，培养箱条件为5% CO2、37℃。待细胞培养至80%的融合度，使用胰酶消化后均匀接种于6 孔板中。每孔加入7 μL 的lipofectmin3000 和2.5 μg circ_ZCCHC24表达载体质粒于细胞培养箱中培养，24 h 后提取RNA，均-80℃保存备用。

表1 引物与探针信息

1.2.4 circ_ZCCHC24 基因表达分析将提取的RNA 反转录为cDNA，操作步骤按照反转录试剂盒说明书进行，设计定量引物（表1），利用qRT-PCR 检测超表达circ_ZCCHC24基因的CHO 细胞中该基因表达水平。qRTPCR 反应总体系20 μL：cDNA 模板各1 μL，SYBR®Green Supermix 10 μL，上、下游引物（0.4 μmol/L）各0.25 μL，去离子水加至20 μL。PCR 扩增程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 个循环；72℃延伸45 s。仪器采用Mini CyclerTM 基因扩增仪，利用2-ΔΔCT方法进行分析。

1.2.5 山羊卵泡颗粒细胞的分离培养山羊屠宰后取出整个卵巢组织，置于装有预冷PBS 的无菌培养皿中；用加有双抗的PBS 缓冲液冲洗血污，漂洗3 次；剥净卵巢中卵泡的外膜、结缔组织等；选取体积适中的卵泡，用无菌一次性针管抽取卵泡液；PBS 洗涤抽取出的卵泡液中的颗粒细胞，重复3 次；将洗涤后的颗粒细胞接种于含15%胎牛血清的DMEM/F12 培养基的6 孔板内，测定细胞密度，调整悬浮液细胞密度为1×106个/mL，置于37℃、5% CO2培养箱内静置培养；颗粒细胞培养24 h 后，更换新鲜含有15%胎牛血清的DMEM/F12 培养基，贴壁后可用于后续研究。

1.2.6 MTT 法检测细胞增殖用5 mL MTT 溶剂溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL 的MTT 溶液；待颗粒细胞培养至80%的融合度，使用胰酶消化后均匀接种于96孔板中。每孔加入0.3 μL 的lipofectmin3000 和0.1 μg circ_ZCCHC24 表达载体质粒于细胞培养箱中培养，依次标记为1、2、3、4、5、6 d，每个时间点设置3 个复孔；分别在上述6 个时间点每孔加入10 μL MTT 溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h；每孔加入100 μL 蓝紫色产物甲臜（Formazan）溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育3～4 h；采用酶标仪在570 nm 测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 山羊circ_ZCCHC24基因编码区扩增提取山羊全血DNA，通过PCR 扩增circ_ZCCHC24基因的全长序列。经琼脂糖凝胶电泳结果显示，片段长度与预期结果相符（circ_ZCCHC24 的全长序列为2 045 bp），并未出现非特异性条带（图1）。

图1 山羊circ_ZCCHC24 基因全长序列的扩增

2.2 山羊circ_ZCCHC24基因表达载体的构建山羊circ_ZCCHC24基因的全长序列的PCR 产物回收产物和pcD2.1 表达载体质粒（图2）经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后，切胶回收。利用T4 连接酶，连接pcD2.1 表达载体质粒和circ_ZCCHC24基因的全长序列的双酶切回收产物，并克隆转化入Ecos 感受态细胞，培养过夜后挑选阳性克隆进行如下鉴定。

图2 环状RNA 表达载体pCD2.1 的模式图

2.2.1 双酶切鉴定将阳性克隆的菌液提取质粒，利用KpnⅠ和BamHⅠ进行双酶切，酶切后分别释放出两条相应大小的特异性条带，较大的条带为表达载体序列，2 045 bp 处为山羊circ_ZCCHC24基因的全长序列（图3），结果与预期相符。

2.2.2 测序鉴定将阳性菌液进行sanger 测序，所得碱基序列利用序列在线比对软件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行比较分析，结果表明，目的片段与NCBI 数据库中提交的片段序列完全一致（图4）。

图3 DKK2 重组质粒双酶切鉴定

2.3 qRT-PCR 检测重组质粒表达效率将山羊circ_ZCCHC24表达载体pc-circ_ZCCHC24 瞬时转染CHO细胞，转染后24 h 提取RNA，利用qRT-PCR 检测重组表达载体质粒的表达效率。由图5 可见，过表达pccirc_ZCCHC24基因后，细胞中circ_ZCCHC24基因的mRNA 表达量升高了41.3 倍（P＜0.01），说明pCD2.1表达载体能够使circ_ZCCHC24基因的线性序列正确成环，载体构建成功，可用于后续实验。

2.4 MTT 法检测重组质粒调控山羊卵泡颗粒细胞增殖经MTT 法检测发现，转染了pc-circ_ZCCHC24 表达载体质粒的山羊卵泡颗粒细胞增殖速率相对于pCD2.1 空载体对照组明显加快，试验组第2 天和第3 天增殖速率与对照组相比达到极显著水平，第4 天增殖速率达到显著水平（图6）。表明过量表达山羊环状RNAcirc_ZCCHC24可以加速山羊卵泡颗粒细胞的增殖。

3 讨论

哺乳动物卵泡的产生是一种由原始卵泡发育成排卵前卵泡的连续复杂过程[14]。其中，卵泡颗粒细胞在卵泡发育过程中发挥重要作用，可为卵母细胞提供必需的生长因子和特定蛋白质，卵泡颗粒细胞的增殖可诱导卵泡的生长和卵母细胞的成熟[15]。卵泡发生的复杂性表现在卵母细胞的发育需要众多基因组成的调控网络来发挥作用[16]。然而，动物卵泡发育和颗粒细胞增殖的决定性调控机制仍需要进一步研究。

长久以来，非编码RNA 被认为是一种转录垃圾，不发挥任何作用。然而越来越多的研究表明，包括miRNAs、circRNAs、piRNA 和lncRNA 等在各种生物学过程中发挥重要的调控功能[2,17-18]。

图4 DKK2 基因表达载体序列测序比对结果

图5 circ_ZCCHC24 基因pCD2.1 表达载体的表达效率

图6 circ_ZCCHC24 基因pCD2.1 表达载体促进山羊卵泡颗粒细胞增殖

本研究主要通过克隆得到山羊新环状RNAcirc_ZCCHC24基因的全长序列，利用基因工程技术构建了circ_ZCCHC24基因的pcD2.1 表达载体。pcD2.1 环状RNA 表达载体是一类特殊的载体，在设计引物时已包含了正反向环化介导序列，可以使circ_ZCCHC24序列过表达后可以正确的环化为环状RNA。所得到的重组环状RNA 表达载体利用双酶切和测序技术验证了正确性。

circRNA 在山羊发育过程中的功能的研究较少，现有的文献大多集中在利用转录组测序技术对羊中环状RNA 进行筛选鉴定。作者前期研究中利用测序技术鉴定了不同繁殖力山羊排卵前卵泡中差异表达的circRNA，并对circRNA 的功能进行了初步研究[19]。Cao 等[20]鉴定了绵羊骨骼肌中circRNA 的表达模式。在羔羊脾脏中，circRNA 表达模式与大肠杆菌F17 的拮抗作用相关[21]。circRNA 对山羊繁殖性能的研究鲜见报道。仅有少量研究表明，卵泡中颗粒细胞分泌的性腺激素对卵泡具有支持作用，对卵巢发挥正常功能至关重要[22-23]。因此，本研究利用circRNA 特定的表达载体，对circ_ZCCHC24表达载体质粒在山羊卵泡颗粒细胞中进行过表达研究，结果发现circ_ZCCHC24可以上调颗粒细胞增殖速率。本研究为深入研究circ_ZCCHC24对山羊卵泡发育的功能奠定基础。