左乙拉西坦对白细胞介素-1β诱导的PC12细胞损伤的抑制作用

韩晶 赵天淼 李丹

(武警吉林省总队医院,吉林 长春 130052)

癫痫是一种由于大脑神经元异常放电所引起的中枢神经系统功能异常的脑部疾病，临床上主要表现为动作的反复性、不可预知性，同时病程长，致残率高〔1，2〕。目前研究认为“神经-免疫-细胞因子”网络能够显著影响中枢神经递质的合成与释放，特别是细胞因子与癫痫的发生密切相关〔3，4〕。其中白细胞介素(IL)-1β作为一种重要的细胞因子，在癫痫等神经系统疾病的发生过程中与其受体相结合，进一步加剧神经细胞的兴奋〔5～7〕。左乙拉西坦是第二代癫痫治疗药物，能够通过调控神经递质分泌，影响受体型钙离子释放，调控电压门控钠通道改变癫痫点射，被较为广泛应用于癫痫的治疗〔8～10〕。但左乙拉西坦对癫痫的治疗作用目前集中于体内动物实验研究，具体相关机制报道较少，因此本研究将通过IL-1β诱导PC12细胞复制体外癫痫模型，探讨左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞损伤的影响及相关机制。

1 材料和方法

1.1细胞株 大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12购于中国科学院细胞库。

1.2试剂与仪器 DMEM培养基，胎牛血清，IL-1β均购于美国Gibco公司；兔抗人MyD88，NF-κB p65，p-NF-κB p65及GAPDH多克隆抗体，肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6检测试剂盒购于美国Abcam公司；Annexin V-FITC/PI流式双染试剂盒，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒，细胞周期检测试剂盒均购于南通碧云天生物技术有限公司；一氧化氮(NO)测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；MK3酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3噻唑蓝(MTT)法检测PC12细胞活力 将5×103个PC12细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，加入0，3，10，30，100，300 μmol/L的左乙拉西坦作用细胞48 h，加入MTT孵育4 h后将上清液甩掉，后加入150 μl的二甲基亚砜，震荡使结晶物溶解，测定吸光值。

1.4细胞分组 将处于对数生长期的PC12细胞随机分为正常对照组，IL-1β组，左乙拉西坦低、中、高浓度组，除正常对照组外，其余组细胞均预先给予10 ng/ml的IL-1β孵育24 h进行模型构建，后左乙拉西坦再分别给予10，30，100 μmol/L的左乙拉西坦培养48 h，正常对照组，IL-1β组分别给予等量的磷酸盐缓冲液(PBS)培养48 h。采用MTT法检测各组细胞活力。

1.5Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡 将9×103个PC12细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按1.4分组并给药48 h后，每组收集1×105/ml个细胞，加入结合缓冲液混匀后，继续加入Annexin V-FITC及PI并混匀，1 h内上流式细胞仪进行细胞凋亡检测并分析。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-6含量 将 9×103个PC12细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按1.4分组并给药48 h后，胰蛋白酶裂解细胞并收集蛋白，严格按照ELISA试剂盒说明书检测细胞中TNF-α、IL-6含量。

1.7比色法检测NO含量 将9×103个PC12细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按1.4分组并给药48 h后，裂解细胞，按照检测试剂盒说明书检测NO含量。

1.8RT-PCR法检测MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白mRNA表达 根据Trizol法提取细胞中总RNA，并检测总RNA的完整性及纯度，当OD260/OD280>1.6说明RNA纯度良好，接着利用反转录试剂盒将RNA反转录并得到cDNA，最后进行琼脂糖凝胶电泳。

1.9Western印迹检测细胞中MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白的表达 将9×103个PC12细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，收集细胞并裂解得到细胞总蛋白，测定蛋白浓度。制作浓缩胶和分离胶，蛋白上样后，进行凝胶电泳，湿法转PVDF膜，脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4℃过夜孵育，二抗室温孵育1 h，于凝胶成像系统中曝光。

1.10统计学分析 采用SPSS17.0软件进行F及t检验。

2 结 果

2.1不同浓度的左乙拉西坦对PC12细胞活力的影响 0，3，10，30，100，300 μmol/L的左乙拉西坦处理PC12细胞48 h后，与0 μmol/L左乙拉西坦处理组(0.43±0.04)比较，10，30，100 μmol/L的左乙拉西坦能显著的提高PC12细胞活力(0.49±0.05，0.57±0.05，0.66±0.06，P<0.01)，而3 μmol/L(0.42±0.04)的左乙拉西坦对PC12细胞活力无影响，300 μmol/L(0.41±0.05)的左乙拉西坦降低PC12细胞活力(P<0.01)。

2.2左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞活力的影响 与正常对照组(0.43±0.04)比较，IL-1β组(0.35±0.03)细胞活力显著降低(P<0.01)；与IL-1β组比较，左乙拉西坦低(0.38±0.03)、中(0.42±0.04)、高浓度组(0.48±0.05)细胞活力显著上升(P<0.01)。

2.3左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞凋亡的影响 与正常对照组比较，IL-1β组细胞凋亡率显著提高(P<0.01)；与IL-1β组比较，左乙拉西坦低、中、高浓度组细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。见表1。

2.4左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞中炎症因子水平的影响 与正常对照组比较，IL-1β组细胞中TNF-α、IL-6及NO含量显著提高(P<0.01)；与IL-1β组比较，左乙拉西坦低、中、高浓度组细胞中TNF-α、IL-6及NO含量显著降低(P<0.01)。见表2。

表1 左乙拉西坦对PC12细胞凋亡的影响

与正常对照组比较：1)P<0.01；与IL-1β组比较：2)P<0.01，下表同

表2 左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞中TNF-α、IL-6及NO含量的影响

2.5左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表达量的影响 与正常对照组比较，IL-1β组细胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表达量显著提高(P<0.01)；与IL-1β组比较，左乙拉西坦低、中、高浓度组细胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表达量显著降低(P<0.01)。见图1、表3。

A：正常对照组；B：IL-1β组；C：左乙拉西坦低浓度组；D：左乙拉西坦中浓度组；E：左乙拉西坦高浓度组；图2同图1 左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA表达量的影响

表3 左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞中MyD88，p-NF-κB p65 mRNA及蛋白表达量的影响

2.6左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞中MyD88，NF-κB 65蛋白表达量的影响 与正常对照组比较，IL-1β组细胞中MyD88，p-NF-κB p65 蛋白表达量显著提高(P<0.01)；与IL-1β组比较，左乙拉西坦低、中、高浓度组细胞中p-NF-κB p65 蛋白表达量显著降低(P<0.01)，左乙拉西坦中、高浓度组细胞中MyD88蛋白表达量显著降低(P<0.01)。见表3、图2。

图2 左乙拉西坦对IL-1β诱导的PC12细胞中MyD88，NF-κB 65蛋白表达量的影响

3 讨 论

细胞因子是“神经-内分泌-免疫”网络系统的重要介质，中枢神经系统能够分泌多种细胞因子，而这些细胞因子作为免疫介质影响着神经细胞功能〔3，4〕。癫痫作为一种与免疫系统密切相关的神经系统性疾病，细胞因子的合成、分泌与癫痫的发生发展密切相关〔5～7〕。IL-1β作为一种重要的细胞因子，通过与神经细胞膜上的受体ILRⅠ结合，进而激活下游信号通路，如激活NF-κB、MAPK信号通路发挥长效作用，激活PI3K、Src信号通路发挥短效作用〔5～7〕。因此本研究将以IL-1β作为诱导剂，诱导PC12细胞损伤作为癫痫体外细胞模型。左乙拉西坦是一种常见的二代抗癫痫药物，研究认为左乙拉西坦主要是通过调控神经递质与SV2A的释放，影响IP3受体依赖性钙释放，或者通过调控电压门控钠通道达到治疗癫痫的目的〔8～10〕。

本研究参考IL-1β在其他正常细胞中的剂量浓度并结合预实验发现10 ng/ml是IL-1β诱导PC12细胞损伤的最适浓度〔11，12〕。另外Stettner等〔13〕研究表明1.5、15.0、150.0 μmol/L左乙拉西坦能显著提高脂多糖诱导的Schwann细胞膜电位，同时能提高细胞的抗氧化、抗凋亡、抗炎等功能。Sendrowski等〔14〕采用高温损伤体外培养海马神经元，结果发现10、50 μmol/L左乙拉西坦能显著抑制神经元热损伤，而300 μmol/L左乙拉西坦反而加剧损伤。本研究结果表明左乙拉西在10，30，100 μmol/L剂量范围内对PC12细胞活力具有促进作用，同时此浓度范围也与Stettner等〔13，14〕，结果较为一致。本研究结果表明左乙拉西坦能显著提高IL-1β诱导的PC12细胞活力，并降低细胞凋亡率，提示左乙拉西坦能够抵抗IL-1β诱导的PC12细胞凋亡。

癫痫发作时候能够诱导神经胶质细胞、神经元分泌大量的IL-1β，IL-1β与其受体ILRⅠ结合后，能够诱导附属蛋白附着，同时招募接头蛋白MyD88到ILRⅠ的结构域，进而激活NF-κB信号通路〔5～7〕。NF-κB是一种具有多种调节功能的核因子，在静息条件下与IκB形成复合物静置于细胞质中，当受到上游细胞因子如脂多糖，IL-1β激活后，上游的IκB激酶被活化，促使IκB磷酸化并与NF-κB p65亚基解离，使p65进入细胞核，调控靶基因的转录。NF-κB被激活后，能促使大量的炎症因子分泌(TNF-α、IL-6及NO)，使这些炎症因子反过来加重癫痫。研究已经显示癫痫发生过程中MyD88/NF-κB信号通路被高度激活，同时伴随着大量炎症因子(TNF-α、IL-6及NO)的分泌〔5～7，15〕。因此抑制炎症因子的分泌能一定程度上减少癫痫引起的脑组织损伤。本研究结果表明乙拉西坦能显著抑制IL-1β诱导的PC12细胞中TNF-α、IL-6及NO的释放，并下调MyD88、p-NF-κB p65的表达。