血浆代谢物对脑出血发病的预测和诊断价值

段克非，由 杨，田步先

脑出血(Cerebral hemorrhage，CH)是一种病情进展快、致死致残率高的临床常见疾病[1]，它是各种原因导致的局部脑组织占位性病变，释放某些活性物质，使周围脑组织发生变性、坏死[2]。临床数据显示，高血压性脑出血是主要的自发性脑出血，占自发性脑出血发生的80%左右[3]。多数生存者均遗留严重的神经功能缺损症状。目前CT和MRI等影像学方法已广泛应用到脑出血的诊断，但因需搬运患者、操作复杂等弊端，发现一些对脑出血诊断和病情演变具有预测价值的血液生物学标记物具有重要意义。

代谢组学(metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学后，致力于研究整个生物体的动态代谢状态、对低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科[4]。该组学在分子层面上探讨疾病导致的代谢物浓度变化，寻找与疾病相关的代谢标记物，为临床治疗提供有力帮助。该技术应用于多种疾病的诊断与预后，如糖尿病肾病[5]、结核病[6]、肿瘤[7]等疾病，然而应用基于代谢组学分析的串联质谱技术检测血浆代谢物指标与脑出血的研究相关性相对罕见。因此本研究通过分析脑出血患者与正常对照者的代谢谱，寻找脑出血发病后的差异代谢物，进一步认识脑出血的发病机制，为临床治疗提供新的方向。

在本文中，高血压性脑出血占绝大多数，根据头部CT扫描发现脑出血的部位主要分布在壳核、脑叶、丘脑等区域。其导致脑出血发病的机制仍不明确，可能与氨基酸、肉碱等代谢循环障碍，加重血压的升高相关，从而诱发脑出血的发生。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究主要纳入2017年5月～2018年11月就诊于锦州医科大学附属第一医院神经内科住院部的患者，分为研究组和对照组。研究组入选标准：(1)符合第4届全国脑血管病学术会议[8]制定的诊断标准及头部CT扫描确诊为脑出血患者；(2)均为自发性首次脑出血；(3)发病至入院行CT扫描检查的时间<24 h。研究组排除标准：(1)脑梗死、颅内肿瘤等其他疾病导致的出血转化、静脉窦血栓等引发的出血；(2)因外伤等其他原因引起的脑出血；(3)严重肝肾疾病及恶性肿瘤；(4)无法配合本次研究实施的患者。对照组入选标准：(1)同期同年龄段健康体检者；(2)无脑出血病史及其他严重疾病史。本研究经锦州医科大学附属一院伦理委员会审查和批准，所有受试者均为自愿参与本研究，并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 专业的医护人员根据统一方案对所有受试者进行指尖血样采集和样品制备。所有受试者于隔夜空腹8 h以上，入院后未进行用药前采集首次指尖血，滴入串联质谱仪(AB SCIEX 4000)检测专用滤纸片的3个孔板中，形成直径大于8 mm且分布均匀的血斑，晾干后送检。应用串联质谱仪对所有样本进行代谢组学分析(具体操作方法可参考相关文献[9])，测得23种氨基酸、35种肉碱和35个对应比值共93个代谢物指标。详细询问并记录受试者的一般临床资料(包括年龄、性别、高血压病史、糖尿病史、吸烟史及饮酒史)。

1.2.2 278例患者均应用80排160层螺旋CT进行扫描，扫描参数设置为120 Kv，600 mA，矩阵512×512，层厚5 mm，层距5 mm。所有患者均在发病24 h之内实施头部CT扫描检查，并对其出血部位、出血量进行观察，同时采用容积测量法对患者的血肿大小进行计算。

2 结 果

2.1 临床资料分析 本研究纳入278例患者，其中研究组为138例，对照组为140例。患者的一般临床资料见表1，研究组和对照组之间的年龄、高血压病、糖尿病、吸烟史及饮酒史有显著性差异(P<0.05)，性别无显著性差异(P>0.05)。受试者头部CT示出血部位、出血量见表2。

表1 受试者一般临床资料

注：a应用卡方检验；b应用独立样本t检验

表2 受试者出血量及出血部位

2.2 OPLS-DA模型 OPLS-DA回归分析是一种预测性建模技术，采用该分析方法筛选脑出血组与正常对照组间差异显著性代谢物，得到相应的散点分布图(见图1)。由图可见研究组和对照组能明显分开(R2Y=0.636、Q2Y=0.583)，说明其预测能力和解释能力较强。Permutation实验累计的R2和Q2(左下部)明显低于原始的R2和Q2值(右下部)，可以证明OPLS-DA模型是稳定的、有效的。[截距：R2(0.0，0.151)，Q2(0.0，-0.246)](见图2)。

图1 OPLS-DA散点图(1：脑出血组：绿色；2：对照组：蓝色)

图2 Permutation实验(1：脑出血组：绿色；2：对照组：蓝色)

2.3 筛选组间差异性代谢物 对血浆中93个代谢物指标进行筛选。筛选出满足VIP>1.0、AUC>0.7及P<0.01条件的指标，共23个(见图3)。

2.4 筛选显著差异代谢物 Logistic回归分析是一种线性回归分析模型，可以很好的说明敏感的代谢物在研究组和对照组的差异。将图3中的23个代谢物纳入Logistic回归分析筛选显著差异代谢物(P<0.05)，最终有8个指标纳入模型，分别是Tyr、Orn/Cit、Phe/Try、Cit/Arg、C4/C8、C18：2、C26、C3DC。并得到回归方程式Y=-1.332*C4/C8+6.519*Orn/Cit-18.297*Phe/Tyr+0.790*Cit/Arg-0.178*Tyr+5.411*C18：2+164.239*C26+81.491*C3DC+2.367。根据此方程式，我们计算一个新指标W。8个代谢物及新指标W在研究组和对照组的表达量见相关性矩阵(见图4)和小提琴图(见图5)。

该图可以看到各个代谢物之间的线性相关程度，红色表示两个变量呈正相关，而且色彩越深、圆形面积越大，表示变量相关性越大。

图4 相关性矩阵图

由左上至右下代谢物依次为W、Tyr、Phe/Tyr、Orn/Cit、Cit/Arg、C18：2、C26、C4/C8、C3DC。小提琴图中每一个点代表个体统计量，各图中间红点所在纵坐标为样本中位数。比较研究组与对照组中位数的大小，可以反应血浆代谢物在两组间差异。此图可以清晰的看出与对照组相比，研究组Cit/Arg、Orn/Cit、Tyr、肉碱(C3DC、C26、C18：2)含量较低，而Phe/Tyr、肉碱(C4/C8)含量较高

图5 小提琴图

图6 ROC曲线

2.5 检验模型预测的准确性 分析新指标W对脑出血的预测价值。用ROC曲线下面积(AUC)的大小评价诊断效果，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。筛选出的8种代谢物曲线下面积值均大于0.7(见图6)，说明异常代谢物对疾病的诊断性有一定的准确性。设定的新指标W为8种代谢物的综合性指标，其AUC的大小为0.993，大于其他所有代谢物AUC，提示结合多种代谢物将会提高对疾病的诊断价值。

3 讨 论

多年来，脑出血的发病率及病死率在全球范围内始终居高不下，寻找新的诊治方案迫在眉睫。对于脑出血患者来说，其在发病之后脑内微小动脉会出现不同程度的痉挛改变，将会导致患者在发病较短时间内出现脑组织缺血缺氧，甚至脑组织坏死，如果不及时治疗，则很可能会出现血肿范围迅速扩大，加重病情，甚至有危及生命的风险[10]。因此，如果及早的发现高灵敏性和特异度的脑出血的代谢物指标，有可能为早期、快速、可靠诊断和预防提供有力帮助。

已有研究表明脑出血后兴奋性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)水平上升，而抑制性氨基酸(甘氨酸、γ-氨基丁酸)水平下降[11]。然而本研究结果发现脑出血组：Cit/Arg、Orn/Cit、Tyr，C3DC、C26、C18：2含量较低，而Phe/Tyr、C4/C8含量较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

鸟氨酸循环是将机体各种代谢途径中产生的氨转换成尿素，经尿液排出体外。在鸟氨酸氨基甲酰转移酶、精氨酸代琥珀酸合成酶和精氨酸代琥珀酸裂解酶等关键酶的作用下，鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸相互转化。同样，研究发现[12]在精氨酸、瓜氨酸、一氧化氮之间也存在一种循环称作瓜氨酸-一氧化氮循环。一氧化氮属于一类重要的内皮功能舒张调节因子，在血压控制中起关键作用，其与高血压的发生发展过程密切相关[13]。本文研究结果显示，脑出血患者Cit/Arg、Orn/Cit降低，其机制可能与上述两个循环代谢障碍相关，从而导致血压改变，同时一氧化氮代谢障碍可产生过多的氧自由基，加重血管内皮细胞损伤[14]，加重出血的发生。研究发现不对称二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶的内源竞性抑制剂可加快血管收缩，因此血压明显升高[15]，容易诱发脑出血。

苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，属芳香族氨基酸。苯丙氨酸在苯丙氨酸羟化酶的作用下转化成酪氨酸，酪氨酸在酪氨酸羟化酶的作用下转化成多巴胺能，生成去甲肾上腺素和肾上腺素。研究发现[16]，血液中苯丙氨酸水平增高，脑电图异常率明显增高，同时对脑血管产生中重度损伤，进而造成脑出血的发生。Kofler等[17]研究表明在患有蛛网膜下腔出血的背景下，测量的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的脑间质水平显着降低，且往往伴有情绪改变。本研究发现，在脑出血患者中Phe/Tyr升高，Tyr降低，其可能与苯丙氨酸代谢途径中的某种关键酶缺乏或关键代谢通路障碍有关，其机制仍不明确，需要扩大样本继续探查。此外，Hufner[18]和Felger[19]研究发现，在多巴胺能/去甲肾上腺素能途径中，患抑郁症的肿瘤患者中血液中Phe/Tyr往往升高。

人体内的肉碱根据碳原子数量可分为长链和短链酰基肉碱。肉碱有重要的生理作用包括：(1)肉碱存在于肌细胞中的线粒体中，β氧化供能；(2)抗氧化作用；(3)肉碱也与参与免疫系统的功能有关，参与支链氨基酸代谢[20]。本文研究中，与对照组比较，脑出血组C3DC、C18：2、C26降低，而C4/C8升高。其原因可能是脂肪酸β氧化功能失调，出现微循环障碍[21]，进而诱发脑出血。Catharina等[22]研究发现随着血清左旋肉碱水平的增加，动态收缩压和舒张压显着增加，并且发现BP与游离左旋肉碱和长链酰基肉碱之间存在独立的正相关性，血压过高有可能诱发脑出血的发生。Soyer 等[23]发现左旋肉碱减少氧化应激所致血管损伤，对脑出血后脑血管痉挛的消退有潜在益处。此外研究发现，短链酰基肉碱与芳香族氨基酸代谢有关[24]。

综上所述，Phe/Tyr、Tyr、Cit/Arg、Orn/Cit、C4/C8、C3DC、C18：2、C26等血浆代谢物指标与脑出血的发病相关。然而，我们需进一步明确这些物质在脑出血发生发展中的机制，为临床治疗提供新的前景。