老年痴呆症患者外周血中LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平及应用价值

李晓峰，张文瑛，梁铁生

老年痴呆即阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)是一种起病隐匿、呈进行性发展的神经系统退行性疾病，以记忆障碍、失语、失用、失认等为主要临床表现，严重影响其工作及生活，同时给家庭和社会带来沉重负担[1]。近年，我国人口老龄化日益严重，AD患病率明显升高，成为继心血管病、癌症及脑卒中之后威胁我国国民生命健康的又一“杀手”，引起全社会关注[2]。但到目前为止，临床上仍缺乏AD早期诊断和治疗的有效手段。近年，随高通量技术的不断完善，长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)作用及功能逐渐被探究出来，成为生物学领域的研究热点之一[3]。越来越多研究表明，lncRNA与AD、帕金森病及亨廷顿病等神经退行性疾病发生发展密切相关[4，5]。有学者研究发现，LncRNA-BC200和LncRNA-17A在AD患者脑组织中异常表达[6]。但其在外周血的表达情况及对AD患者的价值目前探究较少。本研究选取2016年1月～2018年12月于本院收治的97例老年痴呆患者和100例非老年痴呆健康体检者作为研究对象，探讨LncRNA-BC200和LncRNA-17A在老年痴呆患者外周血中的表达情况及临床价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象 入组标准：(1)符合美国国立神经病、语言障碍和卒中研究所-阿尔茨海默病及相关疾病协会的“很可能AD”诊断标准；(2)年龄≥65岁；(3)简易精神状态量表(mini-mental state examination，MMSE)评分低于最低临界值；(4)Hachinski缺血指数量表≤4分。排除标准：(1)合并抑郁症或病史；(2)既往有严重心、肝、脑、肾等内科疾病；(3)合并癌症。遵循以上标准，共纳入97例AD患者，其中男49例，女48例；年龄65～80岁，平均(71.32±6.55)岁。选取同期于本院进行体检的性别及年龄与之相匹配的100例健康体检者作为对照组。所有患者及家属均签署知情同意书，并通过本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 LncRNA-BC200和LncRNA-17A检测 (1)标本收集：抽取两组患者入组后1 d空腹静脉血5 ml于EDTA抗凝管中，4000 r/min离心10 min分离血清，并用2个新的EP管进行分装(用于LncRNA-BC200和LncRNA-17A检测)，于-80℃冰箱保存。(2)总RNA提取：取出EP管解冻，并向其中加Trizol试剂，颠倒混匀，后再向其中加入氯仿，剧烈震荡，离心取上层无色液体至新EP管，加入异丙醇，混匀，离心弃上清，后加入焦碳酸二乙酯使其溶解。(3)逆转录制备cDNA：参考逆转录试剂盒操作说明书准备反应体系(10 μl)：1 μl逆转录酶混合液、1 μl Oligo Dt Primer、5 μl总RNA和3 μl双蒸馏水，在PCR仪上进行变性及退火(37 ℃ 15 min～80 ℃ 10 s)；将制备的cDNA用DEPC液稀释后保存。(4)实时荧光定量PCR：参考荧光定量PCR试剂盒说明书进行，反应体系(25 μl)：上下游引物各1.0 μl、SYBR®Premix Ex TaqTM12.5 μl、cDNA 0.5 μl和双蒸馏水10 μl；反应条件：95 ℃ 3 min预变性、35个循环(95 ℃ 30 s变性、58 ℃ 30s退火、72 ℃ 30 s延伸)，后绘制熔解曲线分析PCR产物特异性；每孔设置3个复孔，取3孔CT平均值作为最后的CT值，以2-△△Ct表示相对表达水平其中以GAPDH为内参基因，LncRNA-BC200上下游引物分别为：5’-CTCAGGGAGGCTAAGAGGCG-3’和5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；LncRNA-17A上下游引物分别为：5’-CCACCCTGAACTGACACAT-3’和5’-GCAAAGGTGCTAATCTTGACTCTTG-3’。

1.2.2 AD患者认知功能评判标准 本研究采用MMSE评判AD患者认知功能，具体包括20个题目，涉及即刻记忆、常识、记忆、地点定向等，得分越低则提示认知功能越差。其中患者教育程度不同其判定为AD的MMSE评分不同：文盲≤17分，小学程度≤ 20分，中学程度(含中专)≤ 22分，大学程度(含大专)≤ 23分。AD严重程度分级：轻度认知功能障碍MMSE≥21分，中度认知功能障碍MMSE 10～20分，重度认知功能障碍MMSE≤ 9分。

2 结 果

2.1 两组外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平比较 与对照组比较，AD组外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

2.2 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A对AD的诊断价值 绘制ROC曲线发现(见图1)，LncRNA-BC200和LncRNA-17A对AD均有一定诊断价值，两者联合可明显提高诊断效能(见表2)。

2.3 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A与MMSE评分的关系 经Pearson相关分析发现，外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A与MMSE评分均呈正相关(P<0.05)，其相关系数分别为0.725和0.684。

2.4 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A与AD严重程度的关系 97例AD患者中，轻度认知功能障碍患者42例，中度认知功能障碍患者31例，重度认知功能障碍患者24例；外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A在重度、中度和低度认知功能障碍患者中依次下降，且差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

组别例数LncRNA-BC200LncRNA-17AAD组对照组tP971001.89±0.421.15±0.3413.61101.56±0.351.07±0.2211.8020

表2外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A对AD的诊断价值分析

指标AUC95%CIP敏感度(%)特异度(%)LncRNA-BC200LncRNA-17ALncRNA-BC200+LncRNA-17A0.7510.7040.8950.723～0.7890.682～0.8370.823～0.9340.0280.042068.4962.4585.8270.1165.2388.83

图1 LncRNA-BC200和LncRNA-17A诊断AD的ROC曲线图

3 讨 论

到目前为止，国内外缺乏诊断AD的早期敏感指标，有文献报道，全球AD患者中仅1/3患者获得早期诊断及干预，大部分患者确诊时已处于AD晚期，给患者生活带来极大伤害[7]。因此寻找敏感、有效、方便且经济的诊断方法已迫在眉睫。LncRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ转录而成，是一种长度超过200个核苷酸的不编码蛋白质的核酸分子，从而被认为是“垃圾”分子[8]。近年，随分子技术的不断发展，LncRNA作用及生物学功能逐渐被挖掘，认为与剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动密切相关[9]。研究发现，LncRNA可广泛存在于人类血液、体液及组织中，且血浆LncRNA在经过反复冻融后仍可保持稳定，而外周血标本获取便捷、经济，促进了血液LncRNA研究的快速发展[10，11]。近年来，越来越多表观遗传学研究表明，lncRNA可参与神经系统疾病的发生与发展，当其表达或功能异常，可直接或间接导致神经退行性疾病的发生[12]。

LncRNA-BC200可在人类神经细胞中特异性表达，主要通过特定调节机制参与神经元细胞突触小体的形成，在一般正常组织中均为较低表达；但近年有研究发现，其在AD患者海马组织中显著高表达，且与临床症状等密切相关，提示LncRNA-BC200对AD具有一定价值[13]。但尚未涉及其在AD患者外周血中的研究。在本研究中，AD组外周血LncRNA-BC200水平明显高于对照组，从外周血水平发现了价值，后来通过绘制ROC曲线图发现外周血LncRNA-BC200可帮助诊断AD，这与王瑶等[14]部分研究结果基本一致，再次突出了外周血LncRNA-BC200检测对AD的价值。LncRNA-17A是近年Massone等[15]在研究中发现的一种与AD相关的新LncRNA，在AD患者脑组织中高表达，主要通过介导GABA信号通路及Aβ 产生参与AD发生发展。Wang等[16]发现LncRNA-17A通过调控SH-SY5Y细胞系的自噬和凋亡构建AD模型，从细胞水平探讨了其价值，但始终未涉及其临床相关研究。而本研究发现，AD患者外周血LncRNA-17A水平明显高于正常体检者，后通过ROC曲线发现其在诊断AD上具有一定价值，从临床外周血水平初步探讨了LncRNA-17A对AD患者的价值。而研究还发现与单项指标比较，LncRNA-BC200和LncRNA-17A联合可明显提高其诊断效能，为AD患者诊疗作出了一定的贡献。认知功能障碍是AD患者主要特征之一，准确判断认知功能障碍及严重程度对AD患者十分重要，但目前临床多以MMSE等作为其判断标准，是一种主观性评价方案，在一定程度上缺乏客观性[17]。本研究通过Pearson相关分析发现，外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A与MMSE评分均呈明显正相关，且在重度、中度和低度认知功能障碍患者中依次下降，提示AD患者外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平越高，其认知功能障碍越严重，有望成为AD患者认知功能障碍评价的客观性指标。

综上认为，LncRNA-BC200和LncRNA-17A在AD患者外周血中异常高表达，与认知功能密切相关，两者联合可帮助诊断AD，为AD患者诊疗提供更多可能。后续可通过扩大样本量和收集范围进行大样本多中心研究，提高本文结果可信度，为其推广贡献一份力量。