9型腺相关病毒携带IL4对阿尔兹海默病模型大鼠学习记忆能力的影响

张淑萍，许鹏娇，辛 华，姜晓雪，刘文娟

阿尔兹海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一组中老年起病的常见的慢性进行性神经系统退行性疾病，伴有认知记忆能力损伤、智力减退和行为人格退化。研究发现AD 患者神经元细胞外淀粉样蛋白(amyloid β- protein，Aβ)沉积，晚期可激活巨噬细胞引发炎性反应。巨噬细胞在中枢神经系统分为两型，M1型巨噬细胞激活后可加重炎症反应，使 Aβ沉积进一步加重而促进AD进展，形成恶性循环。M2型巨噬细胞可通过分泌抗炎因子抑制炎症进展[1]。基于目前国内外研究已知IL-4是激活巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的主要因子[2]。

基因治疗已经成为许多疾病治疗的研究方向，其优点在于只需一次注射便可持续表达目的基因，且安全、转染效率高。随着生物技术的发展，重组腺相关病毒rAAV已经成为外源基因干预治疗研究领域的热点工具载体。在众多用于基因治疗的病毒载体中，目前唯一没有引起人类宿主任何病理反应的是rAAV载体[3，4]，且其宿主范围广、表达稳定，被认为是目前较理想的转运载体。有研究证实在神经系统中AAV9 表达较腺相关病毒其他分型高，且静脉给药时AAV9 血脑屏障通过率较高。基于上述观点，本实验利用过表达IL4的9型腺相关病毒，促使巨噬细胞向M2型极化，研究其对中枢神经系统的影响。

为了评估AAV9-IL4对于 AD的防治作用，行为学测试不可或缺。本实验利用Aβ1-42蛋白沉积制作的老年痴呆模型，在此模型的基础上将过表达IL4的9型腺相关病毒尾静脉注射到大鼠体内，用水迷宫检测模型大鼠的学习记忆能力，从而为针对AD患者临床治疗提供新的线索，为针对AD的免疫治疗提供新的理论依据[5]。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验环境 SPF 级 SD 大鼠75只，雄性，3月龄，体重(300 ±20)g，利用海马区注射Aβ1-42制作老年痴呆模型，实验中应用的所有动物及其饲养按照中国动物保护法相关条例进行，伦理学方面符合黑龙江省实验动物管理委员会要求。

1.2 实验动物分组和处理 利用海马区注射Aβ1-42制作老年痴呆模型的雄性SD大鼠75只，随机分为实验组和对照组，实验组39只大鼠，尾静脉注射AAV9-IL4，对照组36只，尾静脉注射等同剂量的AAV9空载。

1.3 大鼠进行尾静脉注射AAV9-IL4 对已构建好的AD模型大鼠AD手术后1 d就开始进行尾静脉注射包装并测定好滴度的腺相关病毒(滴度5*10^13 v。g/ml)AAV9-IL4与AAV9空载对照。实验组的大鼠经尾静脉注射5 μl AAV9-IL4，对照组大鼠注射同等剂量的AAV9空载，持续14 d。

1.4 水迷宫检测模型大鼠的学习记忆能力 我们分别采用经典的Morris水迷宫进行定位航行实验和空间探索试验来检测手术2 w，4 w，8 w后大鼠的学习记忆能力。水迷宫直径设置为150 cm，高60 cm，第一象限内放置一平台，平台直径12 cm。池水深30 cm(高出平台2 cm)，设置成不透明黑色。大鼠是否能够在水迷宫测试中顺利找到平台，除了受空间、学习记忆能力影响外，还受到大鼠本身视觉以及游泳速度等条件的影响[6]。本实验的根本目的是检验实验大鼠的学习以及记忆能力，所以，参照学习实验设置在水迷宫定位航行实验前，以除外游泳速度以及视觉等因素对大鼠的干扰。

(1)参照学习实验：将大鼠面向池壁在第一象限中央位置放入水中，让其寻找平台。如果60 s内成功找到，大鼠平台上休息10 s；若 60 s内未能找到，则引导至平台上，同样休息 10 s。此目的是确保所有实验大鼠有相等的时间来观察和获取空间信息，除外视觉因素对大鼠的干扰。

(2)定位航行实验：每次随机从4个区域中的其中一个将大鼠面向池壁放入池中，记录大鼠逃避潜伏期(逃避潜伏期：大鼠在池内游泳至找到水面下的平台的时间)。找到平台后，允许大鼠在上停留30 s。若超过60 s后仍然没有找到平台，引导大鼠，潜伏期则记为60 s。定位巡航试验持续5 d，2次/d。

(3)空间探索实验：在定位航行实验后1 d，将水下平台移除。为检测大鼠记忆能力，随机选择一个位置将大鼠面向池壁放入池中，记录大鼠在第1象限内游泳时间占总游泳时间的百分比以及60 s内的穿越原平台象限的次数。

2 结 果

2.1 两组大鼠2 w时间点逃逸潜伏期 通过与对照组比较，实验组大鼠逃逸潜伏期明显缩短(F=140.21，P<0.001)。比较1～5 d实验组大鼠逃逸潜伏期，大鼠逃逸潜伏期明显缩短(F=148.49，P<0.001)，可证明实验组大鼠有学习记忆能力(见表1)。

2.2 两组大鼠4 w时间点逃逸潜伏期 实验组与对照组比较，大鼠逃逸潜伏期明显缩短(F=1018.57，P<0.001)。1～5 d实验组大鼠逃逸潜伏期明显缩短(F=41.69P<0.001)(见表2)。

2.3 两组大鼠8 w时间点逃逸潜伏期 实验组与对照组比较，大鼠逃逸潜伏期明显缩短(F=634.40，P<0.001)。1～5 d实验组大鼠逃逸潜伏期明显缩短(F=34.72，P<0.001)(见表3)。

2.4 两组大鼠穿越隐藏平台的次数及在目标限游泳时间占总游泳时间的百分比 通过与对照组比较，实验组大鼠穿越平台次数明显增多(F=109.23，P<0.001)，且实验组2 w与4 w大鼠穿越平台次数有差别，4 w与8 w相比较差别不明显。在目标限游泳时间占总游泳时间的百分比明显延长(F=675.56P<0.001)，且实验组2 w与4 w在目标限游泳时间占总游泳时间的百分比差别不明显，4 w与8 w相比有差别(见表4)。

表1 2 w时间点逃逸潜伏期比较

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

表2 4 w时间点逃逸潜伏期比较

Comparison between control group and experimental group*P<0.01

表3 8 w时间点逃逸潜伏期比较

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

表4 目标限游泳时间占总游泳时间的百分比

Comparison between control group and experimental group*P<0.001

通过 Two-Way ANOVA统计分析比较各组间逃逸潜伏期，我们发现 IL4-AAV9组SD大鼠逃逸潜伏期明显低于 AAV9组SD大鼠。定位航行实验过程中，我们发现：随着训练次数的增加，各组大鼠池内游泳至找到水面下的平台的时间明显缩短，证明大鼠有学习记忆能力。我们比较了各组大鼠在 60 s内穿越原平台象限的次数及其在第一象限内游泳时间占总游泳时间的百分比。空间探索实验结果显示：IL4-AAV9 组单位时间平均穿越平台次数显著高于AAV9组，且2 w、4 w差异显著，4 w、8 w无明显差异。IL4-AAV9 组单位时间目标象限游泳时间占总时间比显著高于AAV9组，且2 w、4 w无明显差异，4 w、8 w差异显著。

3 讨 论

AD是一种以记忆损害为主，认知功能改变为特征的中枢神经系统退行性疾病。目前普遍认为AD发病机制中的中心环节为Aβ1-42蛋白的沉积，Aβ1-42蛋白的生成与清除失衡是细胞内神经元纤维缠结最终导致老年痴呆发生的主要原因[7，8]。记忆损害是 AD 患者最早期、最典型的临床表现，也是判定AD患者严重程度的重要指标。为了检测记忆能力，行为学检测是 AD 动物实验研究中必不可少的，行为学检测方法多种多样，检测的目标也各有不同[9]。Morris 水迷宫作为行为学检测的一种方法，可以从学习记忆和空间探索两方面来检测大鼠的认知水平。动物的学习和记忆能力也会受到环境、心理和自身等多方面的影响[10]，实验过程中保持室内灯光、湿度和温度不变，排除实验环境的干扰；实验过程中饲养员和实验员固定，排除大鼠心理因素的干扰。

腺相关病毒血清学种类较多，其中AAV9 在 CNS 疾病中的疗效已得到肯定[11～13]。AAV9在不同的注射方式下可展现出不同的转导特性，其转导效率因病毒包装加工、疾病模型和实验方法的不同存在差异。研究表明，肌注腺相关病毒会引发与注射剂量相关的 T 细胞免疫反应[14]，尾静脉给药相比之下较为传统、简单、微创且具有单次注射即可实现 CNS 普遍转导的特点。另外，不同滴度不同注射剂量注射对大鼠学习记忆改善的影响也不尽相同。已知IL-4是激活巨噬细胞向M2型极化的主要因子，本研究利用了海马区注射Aβ1-42制作的老年痴呆模型，在此模型的基础上将过表达IL4的9型腺相关病毒尾静脉注射到大鼠体内，用水迷宫检测模型大鼠的学习记忆能力，结果显示，尾静脉转染AAV9-IL4后，AD大鼠的学习记忆能力和探索能力均得到了明显改善。上述实验结果表明IL4-AAV9能够显著改善SD大鼠的空间学习记忆能力。

因此，应进一步研究AAV9转导IL4使巨噬细胞极化在AD模型中如何发挥作用的可能机制。