CDKN2B-AS1基因多态性与缺血性脑卒中的相关性研究

脑卒中为全世界致死率较高的疾病，其中缺血性脑卒中发病率最高，占60%～80%[1]。既往有研究证实遗传多样性会对脑卒中的发病产生影响。位于9p21.3区域中CDKN2B-AS1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点rs4977574和冠心病的发病具有密切的关系[2-3]，脑卒中和冠心病在发病机制上有诸多相似之处，而此基因多态性和脑卒中的关系目前尚未见文献报道。本研究旨在探讨CDKN2B-AS1 基因多态性与脑卒中发病及其临床特点的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年3月—2018年9月郑州市第一人民医院神经内科收治的212例病人为研究对象。病例组：脑卒中病人118例，其中男65例，女53例，年龄36～70(55.61±6.83)岁；对照组：非脑卒中病人94例，其中男51例，女43例，年龄40～72(56.98±7.06)岁。脑卒中病人入选标准：经临床检查和CT检查确诊为缺血性脑卒中；生命体征平稳，同意参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：有严重的脑卒中并发症或者后遗症，如意识不清、谵妄等；有肝、肾、甲状腺疾病者；有心脑血管疾病病史。本研究经过本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 生化指标检测 使用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝管抽取病人的周围静脉血2 mL。采用生化分子分析仪(美国贝克曼公司)测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)等生化指标。

1.2.2 PCR体外基因扩增 在采集外周血行生化分析的同时，使用EDTA抗凝管抽取病人的周围静脉血5 mL。应用Genechem血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA，于-80 ℃冰箱内保存。SNP检测采用分型技术(SNaPshot技术，也称小测序)，首先将包含目的SNP 位点的基因片段扩增，然后通过延伸反应将SNP位点碱基再次扩增(二次扩增)。延伸反应中引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测，根据峰的颜色得知掺入的碱基种类，从而确定样本基因型。引物序列为F：GGGTTATGGGAAATGCCATG，R：TTGCTGAAGGGACTCAATGAGAG。聚合酶链反应体系：2.5倍标准缓冲液Ⅳ 2 μL，10～20 ng/μL DNA液4 μL，5 μmol引物1.5 μL，5 U/μL卡帕热启动DNA 聚合酶0.15 μL，采用蒸馏水加至总体积10 μL。反应条件为95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30 个循环；72 ℃、10 min。扩增产物质检：取2 μL上样，2% 琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 PCR扩增产物的二次扩增 扩增产物纯化：于15 μL PCR 产物中加入5 μL 虾碱性磷酸酶和2 μL核酸外切酶I，纯化程序为37 ℃、1.0 h，75 ℃、20 min。延伸反应(二次扩增)：纯化后扩增产物1.2 μL，0.2 μmol/L引物混合物2 μL，荧光混合物0.5 μL，10倍标准缓冲液Ⅰ 0.4 μL，采用蒸馏水加至总体积5 μL。反应条件为96 ℃、10 s，53 ℃、5 s，60℃、30 s，共30个循环。延伸产物纯化：取延伸反应产物10 μL，加入1 μL小牛肠碱性磷酸酶，纯化程序为37 ℃、1.0 h，75 ℃、15 min。DNA测序仪测序：96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μL，延伸反应纯化产物1.0 μL，总体积10 μL，95 ℃变性5 min，迅速冰冷4 min，于ABI 3730XL 型DNA 序列检测仪上进行毛细管电泳。

2 结 果

2.1 两组临床特征比较 两组病人在年龄、体质指数(BMI)、TC、LDL-C、HDL-C、高脂血症及高血压病等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，病例组糖尿病患病率明显增高，FPG及HbA1c水平亦明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组临床特征比较

2.2 生物标志物和脑卒中发病的相关性分析 多因素分析显示，HbA1c正常[OR=0.295，95%CI(0.139，0.623)，P=0.001]和FPG正常[OR=3.323，95%CI(0.129，0.809)，P=0.008]明显降低了脑卒中的发生风险。详见表2。

表2 生物标志物和脑卒中发病相关性

2.3 rs4977574多态性与生物标志物的相关性分析 两组病人rs4977574基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。病例组rs4977574的GG、GA、AA三种基因型频率分别为35.6%、44.1%、20.3%，对照组rs4977574的GG、GA、AA三种基因型频率分别为25.5%、44.6%、29.8%，两组rs4977574的GG、AA两种基因型频率比较差异均有统计学意义(P<0.05)，GA基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。病例组等位基因G频率明显高于对照组(55.6%与42.3%，P<0.05)。校正年龄、高血压病史、高脂血症病史、糖尿病史、体质指数、早发冠心病家族史、吸烟史、饮酒史等潜在混杂因素后，(GG+GA)基因型病人相对于AA基因型病人发生脑卒中的风险升高[OR=1.970，95%CI(1.017，3.813)，P=0.048]；携带等位基因G的病人发生脑卒中的风险明显增加[OR=1.24，95%CI(1.05，1.48)，P=0.019]。

在全部病人中，(GG+GA)基因型(169例)和AA基因型(43例)的HbA1c水平分别为(6.18±1.52)%和(6.41±1.31)%，差异无统计学意义(P>0.05)；校正年龄、高血压病史、高脂血症病史、糖尿病史、体质指数、早发冠心病家族史、吸烟史、饮酒史后，(GG+GA)基因型病人高FPG发生率增高[OR=12.429，95%CI(5.358，28.831)，P=0.000]。详见表3。

表3 rs4977574多态性与生物标志物的相关性分析

3 讨 论

脑卒中的发病和诸多因素相关，其中脑卒中相关基因的多态性为近年来的研究热点。根据胡媛[4]的研究，脑卒中病人中血浆同型半胱氨酸(Hcy)异常增高，Hcy异常增高早已明确证实属缺血性脑血管疾病高危因素之一，且Hcy异常增高的心脑血管疾病病人中超过60%属于叶酸缺乏，超过30%病人存在叶酸还原酶基因多态性突变。除此之外，硒蛋白S(SELS)基因、富含亮氨酸重复序列相互作用蛋1(LRRFIP1)基因多态性也和脑卒中的发病相关[5]。董海荣等[6-7]的研究发现，在中国北方人群中或维吾尔族人群中，携带CYP2C19*2等位基因的病人，即基因681中G>A位点单核苷酸多态性在抗血栓治疗时发生氯比格雷抵抗的风险更大。随着研究的深入，更多的可能影响脑卒中发病及预后的基因会逐渐被发现。

CDKN2B-AS1基因位于9号染色体2区1带3亚带，全长126.3 kb，其转录产物为ANRIL。ANRIL是与INK4b-ARF-INK4a 基因座呈转录反义方向的RNA，全长3 834 bp。国内外的研究表明，CDKN2B-AS1基因的表达和心脑血管疾病的发病相关。在Xu等[8]超过12 000名参与者的大样本验证中，提示亚洲人群中携带等位基因G容易发生心血管疾病，特别是心肌梗死。而在加拿大的两项研究中，证实了9p21区和冠心病发病的严重程度和2型糖尿病相关[9-10]。Holdt等[9]对可能的机制进行了探索，发现在外周血单核巨噬细胞中，CDKN2B-AS1的高表达可使细胞增殖加速，黏附力增加，从而增加形成动脉粥样硬化的风险。发生在脑血管中的动脉粥样硬化容易引发脑卒中，本研究以此为切入点，探究CDKN2B-AS1基因和脑卒中之间的相关性。本研究发现，CDKN2B-AS1基因位点rs4977574多态性与脑卒中相关，携带等位基因G的人群更易患脑卒中。除此之外，本研究还对可能的机制进行了探索，rs4977574多态性和血糖水平相关，高FPG会增加脑卒中的发病风险。在缺血性脑卒中病人中，60%～70%存在糖耐量异常或者糖尿病[11]，而在住院人群中更是高达69.7%[12]。Kaplan等[13]的研究提示，糖代谢异常为脑卒中发病的独立危险因素。在国内，卢云飞等[14]的研究指出，在脑卒中的诊治过程中，将HbA1c及TG等生化指标作为参考，可有效地预测和评估脑卒中。在本研究中，携带等位基因G的病人更易出现血糖水平升高，rs4977574多态性和血糖代谢相关，提示等位基因G可能会影响脑卒中的发病。

综上所述，CDKN2B-AS1基因位点rs4977574基因型和糖代谢相关，并和脑卒中具有相关性。