精子DNA碎片指数(DFI)与体外受精结局的多因素Logistic回归分析 *

梁晓东，莫淦文，纪 鹏，沈炳连，廖勇彬

(江门市中心医院生殖医学诊疗中心，广东江门 529000)

随着辅助生殖技术的发展，体外受精(IVF)技术已经得到了广泛的应用，为不孕不育患者找到了孕育生命的希望。在体外条件下使精子和卵子结合受精形成受精卵，是孕育胚胎成功的第一步，也是较为关键的一步。然而，有不少患者夫妇在常规IVF后，仍然没有能够使精子和卵子结合受精，其中所发生的病理机制至今依然不太明确，极大地困扰着患者和医务人员。虽然单精子卵浆内注射(ICSI)技术能一定程度上解决IVF失败的问题，但是这项技术却带来子代安全性的风险。因此探讨IVF失败原因及风险因素，至今依然具有重要的现实意义。目前已知这些风险因素除了卵子因素[1]以外，也存在精子因素，其中，精子DNA碎片与IVF受精率之间的关系受到学界的关注，然而研究结论却大相径庭，有学者认为造成这些研究结论不同的原因主要是纳入研究对象时女方基础条件特别是年龄因素和卵巢储备能力对研究结果造成的影响[2]。的确患者自身或者在超促排卵过程中某些原因可能引起卵母细胞成熟度下降，卵子透明带还没有发育成熟，使精卵结合能力下降，可能也会对IVF结局产生影响，也是不容忽视的因素。而Logistic多因素分析模型可筛选出一些疾病的危险因素并且可说明变量间的相互影响，因此可考虑用其来分析影响IVF结局的各个因素，从而找到精子DNA碎片对IVF结局的实际作用或影响。本文将对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾分析2011～2018年在我中心进行体外受精(IVF)/补救性单精子卵浆内注射(R-ICSI)周期治疗的患者夫妇资料。纳入标准：①受精方式包括常规IVF和R-ICSI；②女方年龄≤35岁；③采用标准长方案治疗的周期。排除标准：①经皮附睾/睾丸穿刺取精(PESA/TESA)周期；②女方卵巢储备功能低下：参照ZHANG等[3]对卵巢储备功能低下的定义标准：基础窦卵泡数<5，或者基础卵泡刺激素>10 U/L，或者曾经出现在前一个卵巢刺激周期获卵数<5的卵巢低反应史；③卵母细胞冷冻周期。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂：精子染色质结构分析试验(SCSA)试剂盒购自深圳华康生物有限公司；密度梯度离心液PureCeptionTM(40/80)(REF ART-2040，ART-2080)，精子培养液Quinn’s HTF medium(REF ART-1020)，卵子冲洗液HTF-HEPES购自CooperSurgical公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)购自Vitrolife公司。

1.2.2 仪器：NovoCyte流式细胞仪购自艾森生物科技有限公司，ICSI显微注射针购自澳大利亚TPC公司，显微操作系统NT88-V3来自于日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 促排卵方案：在促排卵的前1个月经周期的黄体中期开始用促性腺释放激素激动剂(GnRH-a)进行降调。用GnRH-a后16～20天，达到降调标准后使用促性腺激素(Gn)启动，同时B超监测卵泡发育以及测量血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P)水平。当至少1个卵泡直径达18 mm或至少3个卵泡直径达17 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)。注射HCG后34～36 h取卵。

1.3.2 精液采集及处理：男方禁欲3～5天，取卵日用手淫法收集精液，参照WHO第五版标准操作规程进行精子浓度、活力及形态分析。使用上游法或密度梯度离心法分离优选精子。

1.3.3 体外受精和胚胎培养：取卵术得到的卵丘复合物经过冲洗和洗涤后，收集并置于受精滴中，观察其形态以初步判断卵子成熟度。向受精滴加入处理后的精子进行常规IVF，采用短时授精技术，即精子加入4 h后剥离颗粒细胞和冠细胞观察受精情况。若受精率<25%，则采取R-ICSI方案。R-ICSI受精卵需要在R-ICSI后13～15 h观察原核，以判断R-ICSI卵子的受精情况。

1.3.4 SCSA检测精子DNA碎片指数(DFI)：精液液化后用Tris-NaCl-EDTA(TNE)缓冲液进行稀释，取0.05 ml稀释后的悬液置于流式细胞仪进样管中，加入0.1 ml酸处理液处理30 s，再加入0.3 ml吖啶橙染色液，调整精子流速。检测5 000个精子的荧光，用软件分析各种荧光精子的比例并且计算出精子DFI。

2 结果

2.1 患者夫妇一般资料及体外受精状况分析 见表1。从表中可见，组间女方基本条件的差异无统计学意义(P>0.05)，而IVF总受精率随着DFI的升高呈现逐渐下降趋势，R-ICSI的周期数和卵子数占比则呈现逐渐上升的趋势，提示精子DNA损伤可能对体外受精有负面的影响。

2.2 多因素回归模型分析 见表2。把相关风险因素纳入Logistic回归模型进行分析，其中：以是否需要使用R-ICSI技术作为因变量，把因受精率低而使用了R-ICSI技术进行受精的周期设定为1，把只使用了IVF技术进行受精的周期设为0；选定的孕产史自变量中夫妇间有孕产史设定为1，无孕产史设定为0，其他变量则直接使用定量数值。结果显示，精子DFI的OR值为1.013(P=0.005)，提示精子DFI越高，受精率降低的风险逐渐升高。另外从模型分析结果得出，夫妇间孕产史、HCG注射日血清E2，LH水平、获卵数、前向运动精子(PR)总数，精子形态正常率也是低受精率的风险因素。

表1 女方患者的基础条件和体外受精状况

表2 低受精率相关风险因素的Logistic回归分析

3 讨论

IVF技术问世以来给不孕不育患者重新带来孕育新生命的希望，然而仍然存在不少患者夫妇在使用了常规体外受精技术后，仍然没有能够使精子和卵子受精，存在受精率低的情况。后来单精子卵浆内注射技术(ICSI)出现，一定程度上可以解决常规IVF过程中不受精的问题，然而已经有报道证实，使用ICSI技术虽然人工使精卵结合，其优胚率、囊胚形成率等比IVF低，胚胎移植后流产率比IVF要高[4]。而且ICSI技术人工把精子注入卵子内，这些胚胎操作存在着一定的风险，对子代安全性未明。所以探讨影响常规IVF结局的风险因素，预测IVF结局的好坏，依然具有重要的现实意义。

先前已经有相关的报道曾探讨精子DNA碎片对IVF结局的影响，结论也大不相同，其中，对于女方年龄及其基础条件的控制和研究对象的选择是影响结论的关键因素[5]。所以，研究精子因素对IVF结局的影响应该从卵巢储备功能良好的女方患者中选择。尽管如此，仍然存在着一些可能影响结论的不可控制的伴随因素，比如卵母细胞成熟度[6-7]，卵巢反应性等。本研究选取了女性年龄35岁以下，卵巢功能良好的女方患者夫妇作为研究对象，通过对各因素进行多因素分析，提示女方卵子成熟度相关的激素水平、孕产史、男方精液质量对受精情况有着显著的影响，在以上伴随因素情况下，分析结果依然提示精子DNA碎片指数是IVF受精过程中的一个重要的负面影响因素。

通过以上分析，我们发现精子DFI主要影响IVF过程，而对后面的R-ICSI受精影响不大，说明某些患者可通过R-ICSI获得受精，提示了精子DNA完整率可能主要影响自然的精卵结合过程。过去，IVF受精率低，人们通常从顶体酶、顶体反应等方面寻找原因。最近的研究也表明，精子DFI也能影响精子和卵母细胞的结合[8-11]。然而，精子的DNA损伤发生在精子的核，而精子与卵母细胞的识别只发生在两者的表面，精子与卵母细胞发生接触时，是精子膜而不是精子核与卵母细胞膜发生黏附识别。这暗示了精子的DNA损伤可能影响了与卵母细胞的识别过程，目前研究发现这个过程可能与精子表面的热休克蛋白-70(HSPA2)有关[12]。在热应激或精索静脉曲张等不利条件时HSPA2表达上调，可能起保护精子免受外界因素损伤或启动DNA自我修复的作用。AGARWAL等[13]发现，高DFI精子往往伴有HSPA2减少，暗示在精索静脉曲张时精子DNA的损伤可能与HSPA2表达不足有关。而HSPA2能促进精子与卵子透明带的结合，与IVF受精率存在着正相关的关系[14]，这可能是精子高DFI影响体外受精过程的其中一种解释。精子具有一定的自我修复能力[15]，至于为何HSPA2表达不足比较容易产生DNA损伤，以及HSPA2在启动DNA修复中的生理作用，目前还没有直接详细的报道，因此还需要做进一步深入研究探讨。

综上所述，本文利用多因素模型分析研究精子DNA完整性与体外受精结局的关系，发现了精子DNA碎片指数是IVF受精过程中的一个重要的影响因素。精子DNA完整性对于IVF受精情况可能有一定的预测价值，是否可作为选择受精方法的预测指标及DNA损伤的影响机制，仍需要深入的、多中心的进一步研究。