宫颈鳞癌患者癌组织Nemo样激酶的表达与临床病理特征及预后关系研究 *

蒋秋丽，王佩红，苗群英，白 宁，樊阳阳

(1.汉中市中心医院妇科，陕西汉中 723000；2.陕西省人民医院妇产科，西安 710068)

宫颈癌是危害女性身心健康的重要疾病之一，其发病率仅次于乳腺癌，并位居女性生殖系统恶性肿瘤第二位[1]。每年在全球约有50万新增宫颈癌患者，其中在中国新发病例约有13.15万，占全球总发病人数的1/4[2]。根据组织病理特征，宫颈癌可以分为鳞状细胞癌和腺癌，其中鳞状细胞癌占宫颈癌全部组织类型的80%[3]。宫颈鳞癌5年生存率为70%[4]，严重威胁女性身体健康，并给患者带来巨大经济负担[5]。由于宫颈癌早期发病隐匿，大多数患者就诊时疾病已进展至晚期，因此寻找可以预示疾病进展的肿瘤标志物对宫颈癌的防治意义重大，也是宫颈癌相关临床研究的热点。

Nemo样激酶(nemo-like kinase，NLK)是丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，与胞外信号调节激酶及细胞周期蛋白依赖性激酶同源。有研究报道，NLK在肝癌、结肠癌及前列腺癌的发生发展中扮演着重要的角色[6-8]。近年来，NLK与肿瘤细胞的增殖关系已成为肿瘤相关研究的热点，但其在宫颈鳞癌发生发展中的研究尚未见报道。因此，本次研究的目的是探索宫颈鳞癌患者癌组织Nemo样激酶的表达与临床病理特征及预后关系，为宫颈鳞癌患者的诊治及疾病预后的判断提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 在2016年6月～2017年8月，共收集了172例于我院住院治疗的宫颈鳞癌患者，所有病例均由病理诊断确诊。所有纳入患者均接受根治性子宫切除术和盆腔淋巴结切除术，且在术前均未接受过任何形式的化疗及放疗，仅部分高危患者接受了术后放疗。本研究中所有患者均按照国际妇产科联合会所推荐的标准(FIGO)进行术前分期[9]，并收集相关的临床资料。本研究纳入的患者年龄32～70岁，平均年龄为51.24岁；所有患者均采取门诊或电话的方式进行长期随访。本研究中所有患者的随访中位时间达64个月(16～82个月)。用于评价患者预后的总体生存时间(overall survival time，OS)定义为术后至患者死亡经历时间；无病生存时间(disease-free survival time，DFS)定义为手术成功完成至疾病复发所经历时间，患者是否复发均需影像学及病理学证据判断。本次研究报经本院伦理委员会审核批准，并且所有患者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 电泳槽，蛋白标准品，Western杂交仪，硝化纤维素滤膜购自伯乐生命医学产品有限公司；倒置荧光显微镜购自德国徕卡公司；NLK抗体，鼠二抗购自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 Western Blot将宫颈鳞癌病理组织置于RIPA缓冲液与1 mg/dl蛋白酶抑制剂混合溶液中4℃离心15 min。分离物采用双链氨基酸蛋白试剂定量，随后取30 μg蛋白质跑SDS-PAGE，而后转移至甲醇活化的硝化纤维素滤膜。然后加入NLK抗体(1∶1 000稀释)在4℃的条件下孵育过夜。加入二抗在室温下静置1 h，随后曝光显影。

1.3.2 免疫组化：将患者的病理组织石蜡标本切成4 μm的薄片并且用3 ml/dl的过氧化氢溶液在37 ℃的条件下处理30 min，随后加入10 mmol/L的枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)并置于高压锅中2 min。与小鼠抗人NLK单克隆抗体(1∶100稀释)4℃条件下静置过夜孵育。加入鼠二抗，室温孵育20 min。随后将切片浸泡在3，3-四盐酸二氨基联苯溶液中并用苏木紫复染。通过结合显微镜下阳性肿瘤细胞的染色强度及阳性肿瘤细胞百分比来评估NLK的免疫反应。染色结果由两名10年以上病理科工作经验的执业医师独立评价，当结果不一致时由第三名读片人员进行读片以确定最终结果。本次研究中，两位读片人员的读片结果一致率为97.67%。染色百分比按照0%(0分)，<5%(1分)，5%～50%(2分)和>50%(3分)的评分标准进行；染色强度按照无染色(0分)，弱染色(1分)，中度染色(2分)和强染色(3分)的评分标准进行[10]。本次研究染色总得分在0～6分之间，总得分介于0～3分则认为NLK弱表达；总得分在4～6分则认为NLK强表达。

1.4 统计学分析 所有数据均采用SPSS19.0进行统计分析。采用χ2检验分析分类资料组间差异，定量资料则根据数据分布特征采用参数或非参数的方法分析组间差异。进一步采用Log-Rank检验比较不同组别患者总体生存时间(OS)及无疾病生存时间(DFS)的差异并绘制K-M生存曲线。应用COX模型探索NLK表达对总体生存时间(OS)及无疾病生存时间(DFS)的影响，首先逐一纳入不同临床特征因素，在α=0.05的水平下可以确定三个宫颈鳞癌患者总体生存时间的影响因素，分别为NLK表达情况、FIGO分期及淋巴结转移。随后，将三个因素共同纳入模型中，当P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NLK表达情况与宫颈鳞癌患者临床特征间的关系 见图1。可以看出NLK染色主要集中在肿瘤细胞的细胞核。所有肿瘤组织标本中，有76例(44.19%)为NLK低表达；96例(55.81%)为高表达。39例淋巴结转移的患者NLK处于高表达水平的有34例(87.18%)。

注：图a为NLK在肿瘤组织中低表达时免疫组化染色结果；图b为NLK在肿瘤组织中高表达时免疫组化染色结果；图c为转移性淋巴结组织中NLK高表达时免疫组化染色结果。

图1宫颈鳞癌患者病理组织中NLK的表达情况

由表1可以看出，NLK的表达情况在不同年龄、不同FIGO分期、不同病理分级、不同肿瘤直径及不同子宫旁组织累及状态的人群间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。而NLK的表达情况在不同血管/淋巴结浸润状态、不同淋巴结转移情况及不同肿瘤复发情况的人群间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同临床特征研究对象NLK表达情况差异性分析[n=172，n(%)]

2.2 NLK表达与宫颈鳞癌患者预后的关系 见表2。NLK低表达水平的患者平均无疾病生存时间为76.41个月；NLK高表达水平的患者平均无疾病生存时间为53.24个月；Log-Rank检验结果提示NLK低表达水平患者与NLK高表达水平患者间无疾病生存时间的差异有统计学意义(P<0.001)；NLK低表达水平的患者总体生存时间为76.41个月，NLK高表达水平的患者总体生存时间为56.05个月；Log-Rank检验结果提示NLK低表达水平患者与NLK高表达水平患者间总体生存时间的差异有统计学意义(P=0.005)。见表3。可以看出患者的NLK表达情况、FIGO分期及淋巴结转移均是影响患者总体生存时间的风险因素。进一步进行患者无疾病生存时间的影响因素分析，可以看出患者的NLK表达情况及淋巴结转移均是影响患者无疾病生存时间的危险因素。

图2 NLK表达量对宫颈鳞癌患者总体生存时间以及无疾病生存时间的影响

表2 不同NLK表达情况患者生存时间差异性分析

表3 COX模型危险因素分析及因素HR估计

3 讨论

本研究发现，NLK的表达与患者淋巴/血管浸润、淋巴结转移及疾病复发情况有密切关系；COX模型的结果同时表明NLK的表达情况是整体生存时间及无疾病生存时间的独立影响因素。总之，本次研究发现NLK可以作为预示宫颈鳞癌患者进展及预后的指标。通过对已有文献的查阅可以发现，NLK的表达在不同类别肿瘤的细胞中不同。其中，NLK在60%～70%的COS7细胞及HEK293细胞中主要在细胞核中表达，在30%～40%的细胞中主要表达在细胞质中[10]。分析鼻咽癌、肝细胞癌、胶质瘤及胆囊癌的病理组织，发现NLK主要在细胞核表达，在直结肠癌中NLK主要表达在细胞质[10-13]。在本研究中发现宫颈鳞癌患者中NLK的表达主要集中在细胞核。NLK在不同肿瘤细胞中表达位置的不同可能表明NLK在不同肿瘤中通过不同的信号传导通路参与肿瘤细胞生理过程的调节。

有证据表明，NLK既是原癌基因又是抑癌基因，这主要与器官/细胞类型有关。一方面，NLK作为致癌基因，下调该基因的表达可能抑制癌症的发展。研究发现抑制NLK的表达可以减缓肝癌的细胞生长并增加负向调节细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达，达到延缓肝癌恶化的作用[14]；此外，下调NLK的表达可显著降低胆囊癌细胞的增殖和迁移能力[11]。另一方面，NLK可通过抑制细胞增殖、迁移、侵袭或诱导细胞凋亡来抑制癌症的发展。上调NLK的表达可以抑制雄激素受体介导的转录并减少前列腺癌细胞PC-3的数量[8]。在人结直肠腺癌上皮细胞中NLK的过度表达可诱发细胞凋亡，抑制细胞增殖[15]。本次研究发现，宫颈鳞癌病理组织中NLK的表达主要体现为致癌的作用，但还需进一步的细胞试验加以证实，这也是下一步研究的方向。

总而言之，本次研究发现NLK的过度表达在宫颈鳞癌的发生、发展中起着重要的作用并且与患者预后有密切的关系。NLK高表达水平的患者复发风险及死亡风险均较高，这对宫颈鳞癌患者的随访、治疗及预后的判断有重要意义，这也进一步表明通过抑制NLK的过表达可能成为延缓宫颈鳞癌病程发展的方法。