卵巢浆液性腺癌组织锌指蛋白变体(Ciz1-V蛋白)的表达与患者预后的相关性研究 *

凌 玲，桑学涵，尹 静，谢凌云，成 颖，程文国

(1.扬州大学医学院附属医院扬州市妇幼保健院，江苏扬州 225000；2.扬州大学医学院江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室，江苏扬州 225000；3.江苏省苏北人民医院，江苏扬州 225000)

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌。卵巢癌起病较为隐匿，且早期缺乏特异性症状，患者确诊时大多已处于疾病的进展期，其中卵巢浆液性腺癌是病理组织学中最常见类型，约占卵巢恶性肿瘤总数的42.9%[1]，其发病率高、病死率高、易复发、易转移、预后差，严重危害女性生命健康。影响卵巢癌预后的因素较多，根据患者情况综合判断预后是临床医生迫切需要解决的问题。

本课题研究的是一种新的蛋白突变体，即锌指蛋白与周期蛋白依赖性激酶相互作用蛋白1(cyclin-dependent kinase interacting protein 1，Cip1)结合形成的Cip1相互作用的锌指蛋白(Cip1 interacting zinc finger protein 1，Ciz1)的一种稳定突变体，名为Ciz1-V蛋白，前期我们已分析过Ciz1-V蛋白在卵巢浆液性腺癌中的表达及临床意义[2]，后期我们又继续研究与卵巢浆液性腺癌预后相关的因素，本文选取了卵巢浆液性腺癌不同的分级方法以及分期方法，分析Ciz1-V蛋白的表达情况与卵巢浆液性腺癌预后的相关性，目前国内外少见该蛋白在卵巢浆液性腺癌方面的报告。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本文所选40例卵巢浆液性腺癌标本来自于扬州大学医学院附属医院扬州市妇幼保健院和南京医科大学附属逸夫医院2005年～2014年的住院患者，患者的年龄范围为27～59岁，平均年龄47.65±1.26岁，其中以中老年患者居多，患者常见症状为腰痛、腹痛、下肢及外阴部水肿、月经过少或闭经、性激素紊乱等。患者均有完整的病理资料，且术前均未进行放化疗。我们通过查阅患者的病程记录、手术记录以及各项检查报告，将所需信息整理归档，并根据患者的联系方式，采用电话、信息、邮件等相结合的方法，对所研究的患者进行随访，咨询并记录患者的术后生存情况，本研究获医院伦理委员会批准。

根据卵巢癌患者细胞核的异型性、核分裂指数及肿瘤抑制蛋白P53的表达情况，卵巢浆液性腺癌被分为低级别和高级别两级[3]，40例卵巢浆液性腺癌标本中，13例为低级别卵巢浆液性腺癌，27例为高级别卵巢浆液性腺癌。卵巢癌的准确分型对手术方法的选择及术后的放化疗极为重要，在本研究中，卵巢癌的分期主要采用国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)病理分期法，FIGO分期为Ⅰ，Ⅱ期者15例，Ⅲ，Ⅳ期者25例。

所选的40例患者的随访终止日期为2015年4月15日，随访时间为4～121个月，中位随访时间30个月，其中8例患者发生死亡，死亡率为20.0%。生存期定义为患者手术日期至死亡或随访的截止时间间隔。

1.2 方法

1.2.1 实验方法：检测Ciz1-V蛋白所用方法为免疫组织化学法，基本操作步骤如下：a.石蜡组织连续4 μm切片，置于恒温箱内；b.将切片放入二甲苯、无水乙醇中脱水脱蜡后在组织上滴加3 ml/dl过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗后滴加1∶4 000 Ciz1-V蛋白抗体，置于湿盒中4℃冰箱过夜；c.第二天取出玻片，PBS冲洗后滴加二抗(辣根过氧化物酶标记，EnVision试剂盒)，室温下孵育后再次用PBS冲洗；d.滴加二氨基联苯胺显色，放置于自来水中终止反应；放入苏木素中衬染，自来水冲洗后置于返蓝液中并再次用大量自来水冲洗；e.最终将玻片置于无水乙醇、二甲苯，中性树胶封片。

1.2.2 结果判定方法：Ciz1-V蛋白主要定位于胞浆中(见图1)。所有病理切片均由两位资深病理医生进行双盲诊断。本实验采用双评分法判定Ciz1-V蛋白的表达强度，即综合染色强度和着色细胞百分比。选取高倍镜下10个视野分别计数100个细胞：①记录细胞染色强度：未着色为0分；浅棕黄色为1分；棕黄色为2分；深棕黄色为3分；②计算阳性细胞百分比：0%计0分；10%～50%计2分；51%～80%计3分；大于80%计4分。染色反应强度评分和着色细胞的百分比评分，二者相加为综合评分，最终结果表示方法：0分为(-)、(1～2)分为(+)、(3～4)分为(++)、大于5分为(+++)。本研究中我们将Ciz1-V蛋白的表达分为两个等级，(-)和(+)为低表达级别，(++)和(+++)为高表达级别。

EnVision×400

1.3 统计学分析 采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，筛选预后相关因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

FIGO分期为Ⅰ，Ⅱ期者生存率总体趋势高于FIGO分期为Ⅲ，Ⅳ期者，但Kaplan-Meier生存曲线显示本实验中FIGO分期与生存期之间不具有统计学意义(P=0.08)，见图2。

图2 卵巢浆液性腺癌FIGO分期Ⅰ+Ⅱ期患者与Ⅲ+Ⅳ期患者的生存曲线比较

从Kaplan-Meier生存曲线可以看出低级别卵巢浆液性腺癌患者总生存率高于高级别卵巢浆液性腺癌患者，差异有统计学意义(P=0.035)，见图3。在40例卵巢浆液性腺癌患者中Ciz1-V蛋白低表达组预后明显较Ciz1-V蛋白高表达组预后差，差异有统计学意义(P=0.016)，见图4。

图3 高级别卵巢浆液性腺癌与低级别卵巢浆液性腺癌患者生存曲线比较

图4 浆液性腺癌Ciz1-V蛋白高表达患者与低表达患者的生存曲线比较

3 讨论

卵巢癌早期难以发现，70%的患者就诊时已为晚期[4]。了解卵巢癌转移的分子机制对卵巢癌的防治至关重要，但目前与其相关的机制尚未阐明[5]。已知的卵巢浆液性腺癌发病通路存在以下两种：一种发展较慢，由良性肿瘤发展至交界性肿瘤，最终衍变为恶性肿瘤，这种通路是一个循序渐进的过程，存在野生型P53基因；另一种发展较快，由卵巢正常输卵管上皮或囊肿直接发展而来，伴P53基因的突变。近年来随着手术和化疗的进步，卵巢癌患者的生存时间有所提高，其生存率的提高取决于理想的肿瘤细胞减灭术，一般情况下患者首先做肿瘤细胞减灭术，随后无论肿瘤是否被切除干净均需要进行化疗或放疗，初次手术是否彻底对患者的预后具有重要的影响。但卵巢癌患者总体预后仍然较差，其发生、发展、转移的分子生物学机制仍不清楚。因此，早期诊断是改善卵巢癌预后的关键，及时并准确的手术以及术后规范的化疗是提高患者生存率的保证。

肿瘤的准确分期对临床治疗方案的选择具有指导意义，有助于卵巢癌患者的早期诊断和个体化治疗。在本研究中FIGO分期与生存期之间不具有统计学意义，这可能与本实验中病例的选择、肿瘤的异质性以及免疫组化结果评定方法等因素相关。肿瘤的高低分级法跟传统分级法相比更为简单，且重复性较好，临床应用的可行性较高。卵巢浆液性腺癌的肿瘤分级已成为临床上公认的预后影响因素之一，本研究中的结果与该结论相符，低级别卵巢浆液性腺癌患者总生存率高于高级别卵巢浆液性腺癌患者，差异具有统计学意义，肿瘤的分级越高，其生物学行为愈差，肿瘤转移和复发的概率也就随之增加，导致患者的预后越差，生存率越低。

生物学分子在影响卵巢癌细胞增殖或者分化的过程中发挥了重要的调控作用[6]。除了分期、分级等传统的预后因素外，我们需探索一些对其预后有特异性的肿瘤标志物，为患者预后做出更加准确的判断。锌指蛋白是在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFⅢA中发现的一种生物活性物质[7]，在调节基因表达、胚胎发育以及细胞分化等多种生物学过程中均发挥着重要作用，它与Cip1蛋白结合形成Ciz1蛋白。有文献报道，Ciz1蛋白与结直肠癌、前列腺癌、肝细胞癌、膀胱癌等[8-11]肿瘤相关，每一种疾病中可能都存在一个特异性的癌变因素导致Ciz1蛋白或其转录物增加。Ciz1-V蛋白是Ciz1蛋白的一种稳定突变体，有研究发现[12]，Ciz1-V蛋白位于肺部肿瘤的34/35区域，但未表达于肺部肿瘤旁组织，在早期肺癌患者血液中可检测到Ciz1-V蛋白。

本研究中，Kaplan-Meier生存曲线显示Ciz1-V蛋白低表达的卵巢浆液性腺癌患者术后各时点生存率均低于Ciz1-V蛋白高表达的患者，提示Ciz1-V蛋白表达水平的高低可预测卵巢癌患者的预后，有助于正确评估患者的状况，筛选出预后不良的病例，该结果进一步提示Ciz1-V蛋白可能发挥抑癌基因作用，待进一步深入探究后有可能作为卵巢浆液性腺癌的预后的新指标，为临床制定个体化的治疗方案提供依据。

综上所述，Ciz1及其突变体在各种病理过程中都可能存在生物学效应，其表达易受到肿瘤细胞影响，检测卵巢疾病中Ciz1-V蛋白的表达水平可能是区分不同病理分期和病理分级的分子标志物，对临床治疗及预后评估具有重要意义。在未来的医学中，如何更好地通过Ciz1-V蛋白开展卵巢癌的早期诊断、预后分析以及如何通过靶向锌指蛋白来干预卵巢癌的发生发展均是我们研究的重难点。本研究回顾性分析患者临床资料，存在的不足之处是所研究对象的样本量较小，只能在较小的范围内进行数据分析，以后的研究中我们会增加样本量，采用多种方法学，进一步探索卵巢浆液性腺癌的预后相关因素。