烟草黑胫病拮抗菌的筛选、鉴定和防病潜力

陆新莉, 雷 庭, 邱克刚, 江 彤, 丁 婷, 黄衍章, 齐永霞

(1. 贵州省黔南州烟草公司， 都匀 558000； 2. 安徽农业大学 植物保护学院， 合肥230036)

由Phytophthoraparasiticavar.nicotianae引起的烟草黑胫病是植烟区烟草上的重要病害。该病害可以危害晾烟、烤烟、香料烟等所有栽培烟草，已成为制约烟草产业优质、稳产的重要限制因素[1-4]。黑胫病在我国各烟草种植区均有不同程度的发生，皖、豫、云、黔、闽等地发生相对普遍[5-6]。一般田块发病率为5%～12%，重病田块发病率高达75%以上，甚至毁产[1,7-8]。目前，该病的防治仍以使用甲霜灵等苯基酰胺类内吸杀菌剂为主，但长期、大量、单一地使用同一类型杀菌剂，易造成病菌抗药性的产生。采用抗病品种是防治烟草黑胫病最经济、有效的措施，但抗病品种的培育又存在抗源少、育种时间长、抗病性与品种之间存在矛盾等问题[9-10]。生物防治因具有与环境兼容性好、无残留、不伤害非靶标生物等优点，在烟草病害的防治中备受关注。近年来，利用细菌特别是植物根际促生细菌防治植物土传病害的报道也越来越多[11]。目前，已经发现对烟草黑胫病具有防治作用的根际细菌主要是芽孢杆菌(Bacillussp.)[12-15]。

烟草黑胫病是黔南烟区的重要土传病害，严重制约黔南烟叶生产。为明确烟草根际土壤拮抗菌对黔南烟草黑胫病的控制效果，作者从黔南烟草种植区采集样本，通过室内分离、纯化、鉴定，初步筛选出对烟草黑胫病菌具有较好抑制作用的生防菌株；并通过盆栽试验初步探讨了生防菌株对烟草黑胫病的防治效果，以期为丰富烟草黑胫病的生防资源和开发利用优良生防菌株提供指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

烟草黑胫病菌：分离自贵州省黔南州发病烟株，并鉴定为烟草黑胫病菌。

1.1.2 供试药剂

100亿/g枯草芽孢杆菌WP(德强生物股份有限公司)；58%甲霜·锰锌WP(四川国光农化股份有限公司)。

1.1.3 供试培养基

NA培养基[16]；燕麦培养基(OA培养基)[16]。

1.1.4 供试烟草根际土壤

2016年7月在贵州省黔南州贵定、福泉、瓮安、龙里等4个植烟区采集健康烟草根际土壤，带回实验室备用。

1.2 方法

1.2.1 根际细菌的分离

采用稀释涂布平板法[17]。将烟草根际土样过筛后，称取土样10 g，加无菌水定容到100 mL后放入无菌玻璃珠， 200 r/min充分振荡30 min。取上述土壤悬浮液按10n进行梯度稀释至10-6。吸取10-4、10-5和10-63个稀释度的菌悬液0.2 mL，用涂布棒均匀涂布在NA平板上，28 ℃培养2 d，3次重复。选择培养性状不同的单菌落进行纯化培养。

1.2.2 对峙培养试验

采用平板对峙培养法[18-19]。将烟草黑胫病菌在OA平板上活化3 d后，用半径3 mm的打孔器沿菌落边缘制备菌碟。采用十字交叉法，用接种环蘸取1环细菌菌株点接在距平板中心位置2.5 cm处，每个平皿接4点。重复4次。以不接细菌，只接病原菌的平皿作对照， 25 ℃培养3 d，测量菌落半径。菌丝生长抑制率按下式[20]计算：

菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径 ×100%

1.2.3 根际细菌代谢液对烟草黑胫病菌的抑制作用

选择初筛效果好的根际细菌活化后，分别接种于NA培养液中， 37 ℃，180 r/min震荡培养24 h，5000 r/min离心10 min 收集上清液，将上清液过0.22 μm孔径的细菌过滤器后即得到各菌株的无菌代谢液。取2 mL代谢液倒入18 mL OA培养基混匀后制成含代谢液平板，将黑胫病菌菌碟接在平板中央，以不加代谢液的处理为空白对照，4次重复。

1.2.4 烟草根际细菌的分子鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取基因组。16S rDNA扩增引物为XJR：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′；XJF：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′。PCR反应体系为： 基因组DNA模板溶液1.0 μL、dNTP 2.0 μL、10×Buffer 2.0 μL、引物XJF 0.5 μL、引物 XJR 0.5 μL、ExTaqDNA PoLymerase 0.5 μL、加ddH2O至20 μL； PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30 cycles；72 ℃再延伸10 min。PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。系统发育树构建采用DNAMAN软件。

1.2.5 拮抗菌株大田防效试验

1)田间试验设计及施药方法。选择2016年烟草黑胫病重病地自然诱发，烟草品种为云烟87，育苗后移栽。植烟株距55 cm，行距110 cm。烟苗移栽时，每株灌入100 mL稀释药剂，封窝前按同等浓度再灌一次。每处理4次重复，每重复植烟50株。试验处理如下：①YWGJ07按0.5×108cfu/mL灌根处理；②YWGJ07按1.0×108cfu/mL灌根处理；③YWGJ07按2.0×108cfu/mL灌根处理；④100 亿/g枯草芽孢杆菌WP(60 g/667m2)灌根处理(对照)；⑤58%甲霜·锰锌WP(100 g/667 m2)灌根处理(对照)；⑥清水灌根处理(对照)。

2)病害调查方法。2017年6月20日调查田间发病情况。病情分级标准为0级：全株无病；1级：茎部病斑不超过茎围的三分之一，或三分之一以下叶片凋萎；5级：茎部病斑超过茎围的二分之一，但未全部环绕茎围，或二分之一至三分之二叶片凋萎； 9级：病株基本枯死。发病率和病情指数计算公式如下：

发病率(%) =(发病株数/调查总株数)×100%

病情指数=∑(每级发病株数×每级代表值)/(调查总数×最高级别代表值)×100

1.2.6 数据处理

采用DPS 9.50软件。

2 结果与分析

2.1 烟草根际细菌的分离结果

采用稀释分离法从烟株根际周围共分离获得73株根际细菌。具体分离数量、分布地区详见表1。

表1 烟草根际细菌分离结果

2.2 根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

2.2.1 贵定县根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

由表2可以看出，贵定县新铺乡分离的根际细菌中，菌株XPGJ05对烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率最高，达到52.7%。贵定县云雾镇分离的根际细菌以YWGJ07对黑胫病菌的菌丝生长抑制率最高，抑制率为51.8%(表3)。

表2 贵定县新铺乡根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

注：不同的小写字母表示处理组之间在α =0.05水平上差异显著(Duncan多重比较法)；下同

Note: The different lowercase show significant difference among treatments at α =0.05 using the Duncan multiple comparisons. The same below

表3 贵定县云雾镇根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

表4 福泉市根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

2.2.2 福泉市烟草根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

由表4可知，福泉市陆坪镇分离的根际细菌对黑胫病菌的菌丝生长抑制率均在25%以下。福泉市藜山乡分离的根际细菌以LSGJ04对黑胫病菌的抑制率最高，抑制率为53.9%。

2.2.3 瓮安县烟草根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

瓮安县分离的根际细菌对烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率分布在9.6%～51.2%(表5)。其中，WAGJ07对烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率最高，抑制率为51.2%。

表5 瓮安县根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

2.2.4 龙里县烟草根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

由表6可以看出，龙里县分离的根际细菌对烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率分布在4.7%～59.5%。其中，LLGJ04对烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率最大，抑制率为59.5%。

表6 龙里县根际细菌对烟草黑胫病菌的拮抗作用

2.3 根际细菌发酵液对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制作用

代谢液抑菌试验结果显示(表7)，XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04对烟草黑胫病菌菌丝生长的相对抑制率均在50%以上，且菌株间的抑制率存在显著差异。YWGJ07代谢液的抑菌活性最强，菌丝生长抑制率为78.3%。

2.4 拮抗菌的分子鉴定

菌株YWGJ07和LSGJ04经PCR扩增后，均检测到一条大小约1.5 kb的特异性条带[21]。经Blast同源序列比对，菌株YWGJ07和LSGJ04与已经报道的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis(MF167634)和B.velezensis(CP011686)的16S rDNA序列有99%的相似性。采用DNAMAN软件构建各菌株16S rDNA序列系统发育树(图1)，发现菌株YWGJ07和LSGJ04与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis(MF167634)和B.velezensis(CP011686)的亲缘关系最近，而与假单胞菌属、泛菌属和肠杆菌属各菌株的亲缘关系相对较远。因此，初步鉴定YWGJ07和LSGJ04为芽孢杆菌属(Bacillussp.)。

表7 根际细菌发酵液对黑胫病菌菌丝生长的抑制效果

2.5 YWGJ07的田间防效

由表8可以看出，YWGJ07按2.0×108、1.0×108、0.5×108cfu/mL灌根、枯草芽孢杆菌WP灌根和甲霜·锰锌WP灌根对烟草黑胫病的病指防效分别为61.1%、41.1%、38.5%、9.7%和12.2%，其中YWGJ07高、中、低浓度处理的防效均明显高于生防菌对照和杀菌剂对照。结果显示YWGJ07对烟草黑胫病具有潜在的生防价值。

图1基于16 S rDNA序列的LSGJ04和YWGJ07系统进化树

处理Treatments病情指数Disease index防效(%)Control effectsYWGJ07(0.5×108 cfu/mL)27.7 c38.5 bYWGJ07(1.0×108 cfu/mL)26.5 c41.1 bYWGJ07(2.0×108 cfu/mL)17.5 d61.1 a枯草芽孢杆菌WP40.6 b9.7 c甲霜·锰锌WP39.5 b12.2 c清水对照45.0 a—

3 讨论与结论

根际微生物以细菌为主，根据微生物与植物的关系可分为有害、有益和中性3大类。目前，从植物根际分离筛选益生菌防治植物病害已成为生物防治研究的热点，其中对植物生长有促进作用、能够防治植物病害、提高植物产量的一类微生物被称为植物根际促生菌，主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)[21-22]。

芽孢杆菌属是一种常见的植物根际细菌，具有分布广、抵抗力强等诸多优点。应用芽孢杆菌防治植物病害已有很多报道，其生防作用的机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导抗病性等[23-25]。乔俊卿等[26]证实枯草芽孢杆菌可在接种番茄青枯菌的土壤中定殖，这为番茄青枯病的田间防治提供了重要保障。王进等[13]从烟草根际土壤中分离筛选获得1株枯草芽孢杆菌，其对烟草黑胫病菌的菌丝生长抑制率为78.33%，对烟草赤星病菌、烟草青枯病菌均具有较强的拮抗作用。本研究从贵州省黔南州贵定、福泉、瓮安、龙里等植烟区黑胫病重发田块采集健康烟株的根际土壤，通过稀释分离法分离获得73株根际细菌。经对峙培养初筛，细菌XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04对黑胫病菌具有较强的拮抗作用。对峙培养试验中，XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04对黑胫病菌的菌丝生长抑制率分别为52.7%、51.8%、53.9%、51.2%和59.5%。代谢液抑菌试验中，XPGJ05、YWGJ07、LSGJ04、WAGJ07和LLGJ04的相对抑制率分别为71.9%、78.3%、68.7%、69.2%和64.3%。结合对峙培养试验和代谢液抑菌试验结果，筛选获得烟草黑胫病菌优势拮抗菌株YWGJ07，并初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.)细菌。大田防效试验中，YWGJ07高、中、低浓度处理的防效均明显高于生防菌对照和杀菌剂对照，这进一步证实YWGJ07对烟草黑胫病有较好的防治效果。