红曲霉液态发酵产色素及稳定性的研究

邓加聪，杜可，韩艳丽，郑虹,2

(1.福建师范大学福清分校 海洋与生化工程学院，福建 福清 350300； 2.食品软塑包装技术福建省高校工程研究中心，福建 福清 350300)

随着人们健康意识的增强，天然色素越来越受广大消费者的青睐，特别是由红曲霉合成的红曲色素，具有调节血压、抗突变、抑菌等活性，是一类安全、无毒的天然食用色素[1-3]。红曲色素在肉制品、面包制品、豆腐乳制品、酿酒行业等食品制作中都得到了广泛的应用[4-6]。

目前，红曲色素的发酵生产方法主要有固态发酵和液态发酵[7-9]，其中由于液态发酵具有发酵周期短、不易染菌等优点，近年来深受人们的关注。付荣霞等[10]从不同碳源、氮源、pH、装液量等方面对红曲霉产红曲色素的液态发酵条件进行了研究，结果表明：其最佳的发酵工艺条件是以3%玉米粉为碳源，0.02%酵母膏为氮源，pH为4.0，装液量为125 mL/250 mL，此时红曲色素的总色价可达93.66 U/mL。王艳等[11]得到红曲霉产红曲色素的最佳工艺条件为：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5。在此优化条件下，红曲色素色价为105.22 U/mL，比优化前(33.62 U/mL)提高了3.13倍。

为了更好地开发利用红曲色素，本文不仅从装液量、时间、接种量、金属离子及维生素添加量等方面对红曲霉发酵产红曲色素的工艺条件进行了研究，还从pH、光照、添加剂等方面研究了红曲色素的稳定性，为红曲色素的生产及在食品行业中的进一步开发应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红曲霉(Monascusrubber)：保存于福建师范大学福清分校生物工程实验室；蔗糖、蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸锌等试剂：均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；试管斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)；种子培养基(g/L)：蔗糖30、蛋白胨30、KH2PO40.5、MgSO40.5、pH 5.5～6.0；发酵培养基(g/L)：葡萄糖40、蛋白胨30、KH2PO42.0、MgSO41.0、硝酸钠 0.1、pH 6.0。

SPX-150B-Z生化培养箱 福州精科仪器仪表有限公司；722SP分光光度计 上海棱光技术有限公司；TG16-WS高速台式离心机 上海湘仪有限公司；BS224S电子天平 赛多利斯仪器系统有限公司；FA2204B电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；T.HZ-C台式恒温振荡器 太仓市华美生化仪器厂；NRY-2102C恒温培养震荡器 南荣实验室设备有限公司；DKS-24数显恒温水浴锅 上海精密实验设备有限公司；CDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD超净工作台 福州伍联医疗器械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 红曲霉的活化及种子液的制备

挑取4 ℃冰箱保存的红曲霉划线接种于试管斜面，30 ℃活化培养5 d；挑取活化后的红曲霉接至装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min振荡培养3 d。

1.2.2 红曲霉液态发酵优化的单因素试验

将培养好的种子液按不同接种量接至不同装液量，添加不同金属离子浓度及不同维生素浓度的发酵培养基中(添加有数粒玻璃珠)，30 ℃、180 r/min振荡培养一定时间后，发酵液在8000 r/min离心5 min，分别收集上清液和菌丝沉淀，测定上清液的红曲色素。装液量梯度为25，50，75，100，125，150 mL/250 mL三角瓶；接种量梯度为1%、3%、5%、7%、9%、11%；培养时间梯度为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 d；金属离子(硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸铁)添加量梯度为0，0.025，0.05，0.075，0.100，0.125，0.150 mmol/L；维生素(维生素B1、维生素B3、维生素B5、叶酸、维生素H)添加量梯度为0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%。

1.2.3 红曲霉液态发酵优化的正交设计试验

根据单因素试验结果，采用五因素三水平对红曲霉液态发酵进行正交试验设计，其因素和水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 发酵液中红曲色素色价的测定

红曲红色素色价的测定采用GB 15961-2005《食品添加剂 红曲红》。

1.2.5 红曲色素的稳定性研究[12-15]

1.2.5.1 温度对红曲色素稳定性的影响

取10 mL发酵上清液于25 mL具塞试管中，分别置于20，40，60，80，100 ℃水浴中，每隔0.5 h测定色价。

1.2.5.2 光照对红曲色素稳定性的影响

取10 mL发酵上清液于25 mL具塞试管中，分别在18 W日光、自然光、避光下放置，每隔12 h取样测定色价。

1.2.5.3 pH对红曲色素稳定性的影响

取10 mL发酵上清液于25 mL具塞试管中，用0.1 mol/L盐酸或0.1 mol/L氢氧化钠将pH调至1，3，5，7，9，11，室温下放置一定时间，每隔2 h取样测定色价。

1.2.5.4 氧化剂、还原剂及添加剂对红曲色素稳定性的影响

取10 mL发酵上清液于25 mL具塞试管中，分别添加维生素C、双氧水、苯甲酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)及亚硝酸钠等，使其终浓度为100 mg/L。摇匀后，避光保存，每隔2 h取样测定色价。

2 结果与分析

2.1 红曲霉产红曲色素产量的单因素试验

2.1.1 装液量对红曲霉液态发酵的影响

图1 装液量对红曲霉的发酵产色素的影响Fig.1 The effect of loading volume on pigment produced by Monascus

由图1可知，随着装液量的不断升高，红曲霉所产红曲色素的色价含量呈先增后降的趋势；当装液量为75 mL时，红曲色素的产量达到最高，其色价值可达到279.60 U/mL。红曲霉为好氧菌，装液量主要影响液体发酵培养基中的溶氧量，当其他培养条件相同时，随着装液量的增加，发酵液中单位体积的溶氧量下降，红曲色素产量在一定程度上会有所下降。付荣霞等研究发现，装液量125 mL/250 mL时，红曲霉产生的红曲色素最高，总色价可达93.66 U/mL。

2.1.2 接种量对红曲霉液态发酵的影响

图2 接种量对红曲霉发酵产色素的影响Fig.2 The effect of inoculation amount on pigment produced by Monascus

由图2可知，随着接种量的不断升高，红曲霉所合成的色价含量先增大后减小，之后接种量继续增大色价再变小；当接种量为7%时，红曲霉所合成的色价含量达到最高，其色价值可达到373.55 U/mL。接种量过少，菌体生长缓慢，发酵时间长，色素产量低；接种量过多，会导致发酵前期营养物质消耗过快，使发酵液体黏度增加，影响菌丝体生长剂色素的合成和分泌。因此，红曲霉发酵产红曲色素的最适接种量为7%。这与李慧等[16]的实验结果有所不同，李慧等的研究结果表明5%的接种量对红曲霉液态发酵效果较好。

2.1.3 培养时间对红曲霉液态发酵的影响

图3 培养时间对红曲霉发酵产色素的影响Fig.3 The effect of culture time on pigment produced by Monascus

由图3可知，随着培养天数的递增，红曲霉所合成的红曲色素含量逐渐增高，当培养时间为7 d时，红曲色素的含量达到最大，其色价可达429.39 U/mL；之后，随着培养时间的延长，色素含量反而逐渐减少。估计是因为红曲霉发酵培养到一定时间后，体系中的营养物质逐渐耗尽，导致红曲霉生长缓慢，而红曲色素的产量也随之减少。因此选择培养时间7 d为最佳培养时间。而邱鹏等[17]得到的最适培养时间为10 d，红曲霉发酵培养10 d后，其红曲色价可达112 U/L。

2.1.4 金属离子对红曲色素产量的影响

图4 金属离子对红曲霉发酵产色素的影响Fig.4 The effect of mental ions on pigment produced by Monascus

由图4可知，与未添加铜离子的对照相比，加入铜离子后，色价随铜离子浓度的增加而逐渐降低，表明发酵液中的红曲色素产量减少，最后趋于平缓；加入亚铁离子后，色价随亚铁离子浓度的增加逐渐增加，当亚铁离子浓度达到0.01 mmol/L时，色价达到最大值，为503.00 U/mL；之后，色价随着亚铁离子的增加而逐渐减少；当亚铁离子>0.02 mmol/L，色价变化不是很大；与对照相比，发酵液的色价随铁离子浓度增加呈先增后降的趋势，当铁离子浓度为0.01 mmol/L时，色价达到最大值，为512.33 U/mL。

2.1.5 维生素对红曲色素产量的影响

图5 维生素对红曲霉发酵产色素的影响Fig.5 The effect of vitamins on pigment produced by Monascus

由图5可知，与对照CK(红曲色素产量为476.40 U/mL)相比，不同维生素对红曲霉产红曲色素的影响各不相同，维生素B1和维生素B3对红曲色素产量有促进作用，维生素B5和叶酸对红曲色素产量影响不大，而维生素H对红曲色素的合成具有抑制作用。不同浓度的同一种维生素对红曲色素产量的影响，都是先增后降；其中当维生素B1和维生素B3的浓度为0.03%时，红曲色素的产量均达到最大，分别为647.02 U/mL和635.26 U/mL。这与杨成龙等[18]得到的结果相一致。

2.2 红曲霉液态发酵优化的正交设计试验

为了探讨红曲霉液态发酵的最适条件，采用七因素三水平对装液量、接种量、培养时间、硫酸亚铁添加量及维生素B1添加量5个因素进行正交试验。正交试验结果分析见表2。

表2 L18(37)正交试验结果的直观分析Table 2 Visual analysis of results of L18(37)orthogonal test

由表2极差分析可知，D>E>B>C>A，即影响红曲霉液态发酵产色素的因素顺序为：硫酸亚铁添加量>维生素B1添加量>培养时间>接种量>装液量。根据各试验因子的平均值，得到最佳组合为A3B2C3D1E3，即：装液量为100 mL/250 mL，培养时间为7 d，接种量为9%，硫酸亚铁添加浓度为0.005 mmol/L，维生素B1添加浓度为0.05%。

2.3 验证试验

由正交表得到的最佳组合(A3B2C3D1E3)与试验结果得到红曲色素产量最高的组合(A2B2C3D1E2)不一致，因此对两个组合进行验证试验，验证试验结果见表3。

表3 验证试验结果Table 3 Results of verification test

由表3验证试验结果可知，组合A2B2C3D1E2与组合A3B2C3D1E3相比，前者对红曲霉液态发酵的效果更佳。即当培养装量为75 mL/250 mL，培养时间为7 d，接种量为9%，硫酸亚铁添加浓度为0.005 mmol/L，维生素B1的添加浓度为0.03%。在此条件下，红曲霉的色价可达714.80 U/mL。

2.4 红曲色素稳定性研究

2.4.1 pH对红曲色素稳定性的影响

图6 pH对红曲色素稳定性的影响Fig.6 The effect of pH on the stability of Monascus pigment

由图6可知，在同一时间下，红曲色素的色价随着溶液中pH值的升高而呈先增后降的趋势，当pH为7时，红曲色价均达到最大值；在同一pH溶液中，红曲色素的色价基本上随着时间的延长呈先增后降的趋势，但是变化趋势不是很明显。因此，红曲色素最适保存的pH为7。

2.4.2 光照对红曲色素稳定性的影响

由图7可知，不同光照对红曲色素色价的影响各不相同，在同一时间下，光照对红曲色素色价的影响如下：紫外光>自然光>18 W日光>避光；对于同一种光照方式，红曲色素的色价均随着光照时间的延长而逐渐降低。因此，红曲色素避光保存的效果最佳。

图7 光照对红曲色素稳定性的影响Fig.7 The effect of illumination on the stability of Monascus pigment

2.4.3 食品添加剂对红曲色素稳定性的影响

图8 食品添加剂对红曲色素稳定性的影响Fig.8 The effect of food additives on the stability of Monascus pigment

由图8可知，食品添加剂苯甲酸钠和亚硝酸钠对红曲色素具有一定的增色作用，但是添加一定量的EDTA会使红曲色素的色价降低，维生素C和双氧水对红曲色素的影响不大。

3 结论

试验对红曲霉的液体摇瓶发酵工艺进行了初步研究：考察了装液量、时间、接种量、金属离子及维生素等因素对红曲霉液体发酵产红曲色价的影响。结果表明：当培养装液量为75 mL/250 mL，培养时间为7 d，接种量为9%，硫酸亚铁添加浓度为0.005 mmol/L，维生素B1添加浓度为0.03%时最有利于红曲霉合成红曲色素，其色价可达714.80 U/mL。

从光照、pH和食品添加剂对红曲霉所产红曲色素的稳定性方面进行初步研究，研究结果发现，在同一时间下，红曲色素的色价随着溶液中pH值的升高而呈先增后降的趋势，当pH为7时，红曲色价均达到最大值；在同一pH溶液中，红曲色素的色价基本上随着时间的延长呈先增后降的趋势，但是变化趋势不是很明显。在同一时间下，光照对红曲色素色价的影响如下：紫外光>自然光>18 W日光>避光；对于同一种光照方式，红曲色素的色价均随着光照时间的延长而逐渐降低。食品添加剂苯甲酸钠和亚硝酸钠对红曲色素具有一定的增色作用，但是添加一定量的EDTA会使红曲色素的色价降低，维生素C和双氧水对红曲色素的影响不大。这与全桂静等[19]的研究结果相一致。