复方甘草清疡合剂HPLC 指纹图谱

吴逸晨， 谢 辉， 毛春芹， 张梦晨

（南京中医药大学药学院，江苏 南京210046）

复方甘草清疡合剂是由甘草、珍珠母、黄连、黄芩、干姜等药味组成，根据南京市中医院临床有效经验方研制而成的新制剂，临床用于治疗脾胃虚弱引起的复发性口腔溃疡等病症，具有显著疗效。

中药指纹图谱是一种被国内外广泛接受的质量评价手段，可以提供丰富的鉴别信息，反映中药复杂化学体系的整体性质，对中药质量的控制有重要意义。在构建现代中药质量标准体系框架的过程中，中药指纹图谱应当作为核心技术［1］。因此，为了更好地控制制剂质量，获得稳定的疗效，本研究采用HPLC 研究并建立了复方甘草清疡合剂的指纹图谱，以期为其质量控制提供依据。

1 材料

Waters 2695 高效液相色谱仪 （美国Waters 公司）；TGL-16C 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；CAV64C 电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）。乙腈、甲醇（均为色谱纯，美国Tedia 公司）；磷酸（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，无锡市亚盛化工有限公司）；水为超纯水。

甘草 酸 单 铵 盐 （批 号201803）、 黄 芩 素 （批 号200571）、盐酸小檗碱（批号200915）、盐酸黄连碱（批号201118）、盐酸巴马汀（批号200908）、表小檗碱（批号201214）、6-姜辣素（批号201838） 均购自上海源叶生物科技有限公司；黄芩苷（批号200514） 购自中国食品药品检定研究院；汉黄芩素（批号64320010） 购自上海安谱实验科技股份有限公司，对照品含有量均大于98.0%。甘草、黄连、黄芩等饮片由安徽省金芙蓉中药饮片有限公司提供；珍珠母、干姜等饮片由四川新荷花中药饮片股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 样品制备及处理

2.1.1 全方制剂 按复方甘草清疡合剂制备工艺，制备10 批 制 剂 （S1 ～S10）， 批 号 分 别 为180701、 180702、180703、 180704、 180705、 180706、 180707、 180708、180709、180710，备用。

2.1.2 单味药制剂 按复方甘草清疡合剂制备工艺，分别制备方中各味药的单味药制剂，备用。

2.1.3 阴性制剂 按复方甘草清疡合剂制备工艺，分别制备方中各味药的阴性制剂，备用。

2.1.4 供试品溶液 精密量取上述制剂各1 mL，分别置10 mL量瓶中，加水定容，摇匀，高速离心（12 000 r／min，10 min），取上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.5 对照品溶液 精密称取甘草酸单铵盐、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、表小檗碱、6-姜辣素对照品各1 mg，置于10 mL 量瓶中，加入适量甲醇，超声溶解，加甲醇定容，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2 色谱条件 Waters XTerra C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～6 min，19%A；6 ～55 min，19%～26%A；55 ～80 min，26%～71%A；80 ～85 min，71%～19%A；85 ～90 min，19%A）；体积流量0.8 mL／min；柱温25 ℃；进样量10 μL；检测波长237 nm。

2.3 指纹图谱参照峰 所建立的指纹图谱中，15 号峰（后经对照品对比可知为黄芩苷） 具有最大的峰面积、适中的保留时间及稳定的峰型，因此选其为参照峰。在后续内容中，均以该峰作为参照，以计算其余峰的相对峰面积及相对保留时间。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取“2.1.5” 项下对照品溶液，在“2.2” 项条件下连续进样6 次，测得各峰峰面积及保留时间的RSD 分别为2.154%～2.331%、0.009%～0.215%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取 “2.1.1” 项下全方制剂， 按“2.1.4” 项下方法，平行制备6 份供试品溶液，在“2.2”项条件下分别进样，测得各共有峰峰面积及保留时间的RSD 分别为1.104%～2.153%、0.052%～0.892%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取“2.1.4” 项下供试品溶液，在“2.2” 项条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测得各共有峰峰面积及保留时间的RSD 分别为1.280%～1.969%、0.033%～1.069%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 共有模式及相似度 取10 批复方甘草清疡合剂，按“2.1.4” 项下方法分别制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，将所得色谱图以cdf 格式保存，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本），以平均数法生成复方甘草清疡合剂的指纹图谱共有模式，见图1～2。

图1 10 批合剂HPLC 指纹图谱

取10 批复方甘草清疡合剂，按“2.1.4” 项下方法分别制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，将所得色谱图以cdf 格式保存，与共有模式一同导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本），参照15 号峰，计算其余各峰的相对保留时间及相对峰面积；以共有模式作为参照图谱，设其相似度1.000，计算10 批煎液的相似度，结果见表1～3。

图2 复方甘草清疡合剂指纹图谱共有模式

表1 10 批合剂共有峰相对保留时间

根据上述结果可知，10 批复方甘草清疡合剂指纹图谱的相似度均大于0.95，图谱中各峰的相对保留时间及相对峰面积差异亦较小，表明该方法稳定、可行，得到的复方甘草清疡合剂指纹图谱相似度良好。

2.5.2 共有峰归属 取“2.1.4” 项下各供试品溶液及“2.1.5” 项下对照品溶液，在“2.2” 项条件下分别进样，将所得色谱图进行对比，见图3。结果表明，对照品溶液中各成分在全方合剂图谱中均能出峰。除汉黄芩素及6-姜辣素外，各阴性制剂图谱提示上述其他成分均无干扰，表明这些峰具有较好的专属性，可作为复方甘草清疡合剂指纹图谱中被确认化学本质的特征峰。

表2 10 批合剂共有峰相对峰面积

表3 10 批合剂相似度

复方甘草清疡合剂指纹图谱中共可确定30 个共有峰，标号为1～30。组成全方的药味中，黄芩对全方指纹图谱的贡献度最大，其次为黄连、甘草、干姜。30 个共有峰中，2、6、7、26、27、30 号等6 个峰来自甘草，但其中7 号峰有一定干扰；7、8、9、15、18、19、20、21、22、23、28、29 号等12 个峰来自黄芩，但7、8 号峰有一定干扰；1、3、4、7、8、10、11、12、13、14 号等9 个峰来自黄连，但7、8 号峰有一定干扰；28 号峰来自干姜，但有一定干扰。上述共有峰中，7 号峰由黄连、黄芩2 味药叠加而成，8 号峰由甘草、黄芩、黄连3 味药叠加而成；28 号峰由黄芩、干姜2 味药（汉黄芩素、6-姜辣素）叠加而成，但在黄芩阴性制剂图谱中未见28 号峰，干姜单味药制剂图谱中28 号峰也极小，推测是由于干姜在处方中剂量较小，且其主要有效成分易挥发，在合剂制备过程中转移率低而导致。除7、8、28 号峰外，其余特征峰无干扰，有较好的专属性。

在共有峰的归属过程中，5、16、17、24、25 号峰未能归属到任何一味药中，可能是方中诸药在合煎过程中相互作用生成了新成分。

3 讨论

本实验建立了复方甘草清疡合剂HPLC 指纹图谱，从中指认了30 个共有峰，并通过对照品确认了其中9 个峰的化学本质，分别为甘草酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱、6-姜辣素。同时，测定了10 批复方甘草清疡合剂的指纹图谱，其相对保留时间及峰面积值较为稳定，相似度高，表明该方法可作为复方甘草清疡合剂质量控制的依据。

复方甘草清疡合剂中的主要药味甘草、黄连、黄芩等均为常用中药，其在复方制剂中的指纹图谱研究也多见报道［2-8］。课题组在分析相关文献后发现，供试品处理方法多较为繁琐，且部分共有峰分离度不能达到满意的效果。本研究曾比较了水稀释液与醇沉上清液的图谱，未见明显差异，故最终选择了药液用水稀释后直接进样的方法，操作简单、节省资源，且共有峰的分离度理想，为这些中药的指纹图谱研究提供了新思路。

图3 各成分HPLC 色谱图

本研究采用不同浓度的磷酸水溶液、三乙胺水溶液作为水相，结果表明0.1%磷酸水溶液有较好的洗脱能力和分离能力，尤其是对于制剂中黄芩、黄连主要成分有良好的分离效果，故最终选择其为水相。同时比较了乙腈和甲醇2 种有机相，结果发现甲醇不能较好地对样品进行洗脱和分离，故选择乙腈为流动相。此外，还比较了不同柱温、不同色谱柱对特征峰分离度的影响，最终确定使用Waters XTerra C18色谱柱，柱温25 ℃。

本研究建立的复方甘草清疡合剂指纹图谱中有部分药味没有指认到共有峰，可能是由于这些药（如珍珠母） 中的主要成分［9］不适宜使用该色谱条件进行测定，故该色谱条件下无法对这些药进行质量控制，后续应尝试采用其他方法控制其在本方中的质量。

在进行共有峰归属的过程中，推测5、16、17、24、25号峰可能是诸药合煎生成的新成分，这些新成分的出现可能使中药复方比单味中药具有更多的药理作用或更强的疗效，体现了中药配伍运用的合理性，这也与多数学者的研究观点相符合［10］。

在分析复方甘草清疡合剂的指纹图谱时，发现与单味药制剂相比，全方制剂中来自黄芩、黄连的共有峰峰面积有显著下降。通过文献分析可知［11-15］，黄芩、黄连在共煎时会产生大量络合物沉淀，从而使来自黄芩、黄连的成分在水煎液中含有量大幅度降低。另有文献表明，黄芩黄连共煎沉淀物的生物利用度极低16-17］，故后续可进一步研究黄芩、黄连共煎是否会降低疗效及如何提高其生物利用度等。

此外，通过分析各批次指纹图谱中共有峰的相对保留时间及相对峰面积，发现各批次间所有共有峰的相对保留时间差异都极小，但某些共有峰在各批次间的相对峰面积有较显著的差异，这可能是不同批次的制剂所使用的原料饮片存在一定的质量差异，从而造成了这一结果。因此，后续研究可从不同产地饮片的质量入手，选择优质原料药，严格控制制剂的质量，以期获得较佳的临床疗效。