迷迭香酸甲酯在大鼠脑核团内的分布

李 刚， 曹桂云， 张良聪， 王秀秀， 吕美华

（1.菏泽医学专科学校，山东 菏泽274000；2.扬州大学医学部，江苏 扬州225001；3.菏泽市立医院，山东 菏泽274000）

迷迭香酸甲酯（C19H18O8）是具有多个羟基的木脂素类化合物，已从多种唇形科植物，如丹参、绒毛栗色鼠尾草、冬凌草、石见穿、紫苏中分离得到，具有多种生物活性，如抗菌［1］、抗氧化［2］、抗炎、抗糖基化［3］等，另外前期研究表明它可较好地抑制胃癌细胞增殖迁移［4］、抗帕金森［5-6］，但其在脑核团分布的动力学变化如何尚不明确，这对于证实其体内过程、生物活性及可能作用机制具有重要意义。因此，本实验对迷迭香酸甲酯的脑核团分布进行了研究。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、DAD 检测器、ChemStation 数据处理工作站（美国安捷伦科技公司）； MIKRO 22R 台式冷冻离心机 （德国Hettich 公司）；YMC ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） （日本YMC 公司）。

1.2 试药 迷迭香酸甲酯、迷迭香酸乙酯（内标） 由本课题组从绒毛栗色鼠尾草中分离纯化得到［7］，其化学结构经核磁共振波谱和质谱确认，HPLC 面积归一化法鉴定其含有量大于98%。乙腈为色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 动物 Wistar 健康雄性大鼠，体质量250 ～280 g，购自扬州大学比较医学中心，许可证号SYXK（苏） 2012-0029，在（25±1）℃、光暗周期12 h 环境下，给予清洁级普通大鼠饲料（扬州大学比较医学中心）。实验前12 h，大鼠禁食不禁水。

2 方法

2.1 内标、工作溶液制备 精密称取迷迭香酸乙酯（内标） 适量，甲醇配制成50 μg／mL 内标溶液。精密称取迷迭香酸甲酯适量，甲醇配制成2.00 mg／mL 贮备液，再将其稀释成系列质量浓度的工作溶液，密封，置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2 分组、给药及标本采集 60 只大鼠随机分为空白组和给药组，其中给药组大鼠按20 mg／kg 剂量尾静脉注射迷迭香酸甲酯（溶于15%乙醇中）。各组大鼠于给药后3、8、15、22.5、30、45、60、80、100、120 min 后脱颈椎处死，冰盒上迅速取脑，分离海马、纹状体、丘脑、下丘脑、大脑皮层、小脑、脑干，于-20 ℃下冷冻备用。

2.3 样品预处理 精密称取各脑核团组织，加入2 倍量生理盐水匀浆，取1 mL 匀浆液于洁净离心管中，加入20 μL内标溶液、2 mL 乙酸乙酯后涡旋混合1 min，4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液，残液再加入2 mL 乙酸乙酯萃取1次，合并有机相，45 ℃下N2吹干，残渣溶于500 μL 甲醇中，0.45 μm 微孔滤膜过滤。

2.4 色谱条件 采用RP-HPLC 法进行分析。YMC ODS C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（40 ∶60）；体积流量0.8 mL／min；柱温25 ℃；检测波长336 nm；进样量20 μL。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 取各空白脑核团匀浆液，加入工作溶液和20 μL 内标溶液，按“2.3” 项下方法预处理，设置6 个质量浓度，每个平行3 份，在“2.4” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），迷迭香酸甲酯与内标的峰面积比值为纵坐标（Y） 进行回归。

2.5.2 最低检测限（LLOD）、最低定量限（LLOQ） 各空白脑核团匀浆液加入贮备液和20 μL 内标溶液，配制成回归方程末端质量浓度，并逐渐降低，以检测成分的信号与噪音信号比为3 ∶1 时的质量浓度为LLOD，10 ∶1 时的为LLOQ，平行3 次。

2.5.3 准确度、精密度试验 各空白脑核团匀浆液加入适量贮备液和20 μL 内标溶液，配制成高、中、低质量浓度，平行3 份，按“2.3” 项下方法预处理，在“2.4” 项色谱条件下进样测定，同1 d 连续进行3 次，计算日内精密度；连续进行3 d，每天1 次，计算日间精密度。

2.5.4 萃取回收率试验 各空白脑核团匀浆液加入适量贮备液和20 μL 内标溶液，配制成高、中、低质量浓度，平行3 份，按“2.3” 项下方法预处理，在“2.4” 项色谱条件下进样测定，以匀浆处理后脑核团样品峰面积与等量迷迭香酸甲酯直接加到甲醇中后峰面积的比值为萃取回收率。

2.5.5 稳定性试验 各空白脑核团匀浆液加入适量贮备液和20 μL 内标溶液，配制成高、中、低质量浓度，平行3份，将组织液放入-20 ℃冰箱中冷冻24 h，室温下再放置1 h后解冻，平行3 次，按“2.3” 项下方法预处理，在“2.4” 项色谱条件下进样测定，考察冻融稳定性。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性 在“2.4” 项色谱条件下，迷迭香酸甲酯、内标保留时间分别为8.9、12.3 min，内源性物质无干扰，表明该方法专属性良好。色谱图见图1。

3.1.2 线性关系 表1 显示，各脑核团中迷迭香酸甲酯在相应质量浓度范围内线性关系良好（r＞0.990）。

表1 迷迭香酸甲酯在各脑核团中的线性关系

3.1.3 LLOD、LLOQ 迷迭香酸甲酯LLOD、LLOQ 分别为0.02、0.06 μg／g。

3.1.4 准确度、精密度 表2 显示，迷迭香酸甲酯在各脑核团中的日内、日间精密度RSD 均小于15%，日内、日间准确度分别在88.62%～112.28%、88.44%～114.22%之间，表明该方法精密度、准确度良好。

3.1.5 萃取回收率 表2 显示，迷迭香酸甲酯在各脑核团中的萃取回收率大于80.26%，表明该方法萃取回收率良好。

图1 迷迭香酸甲酯HPLC 色谱图

表2 迷迭香酸甲酯精密度、准确度、萃取回收率、稳定性试验结果（n＝3）

3.1.6 稳定性 表2 显示， 迷迭香酸甲酯准确度在94.37%～106.85%之间，表明该成分在冻融条件下稳定性良好。

3.2 迷迭香酸甲酯脑核团分布 图2 显示，迷迭香酸甲酯可透过血脑屏障快速广泛地在脑核团内分布。给药后8 min左右，该成分含有量在大脑皮层、丘脑、纹状体、下丘脑、小脑、脑干中达到峰值，之后缓慢下降，但在120 min 后仍可检测到；给药后45 min，该成分含有量在海马中达到峰值，之后缓慢下降，但在120 min 后仍可检测到，达峰浓度依次为海马＞丘脑＞大脑皮层＞小脑＞下丘脑＞纹状体＞脑干，即有向海马富集的倾向。

图2 迷迭香酸甲酯在各脑核团中的浓度-时间曲线

4 讨论

本研究建立了一种简便、快捷、灵敏的RP-HPLC-UV法来检测迷迭香酸甲酯在大鼠脑核团内的分布，该方法专属性、线性关系、精密度、萃取回收率、稳定性均满足生物样品分析要求。结果显示，大鼠尾静脉注射给药后迷迭香酸甲酯通过血脑屏障在脑核团内迅速广泛的分布，在7个脑核团中都能定量检测到该成分，但在海马中的含有量明显高于其他脑核团中，提示其在海马中有富集倾向。海马体位于大脑丘脑和内侧颞叶之间，属于边缘系统的一部分，主要负责长时记忆存储转换及空间信息存储，日常生活中的短期记忆都储存在其中，临床上很多疾病的发生与海马体有着重要联系，如几乎所有癫痫患者的发作都是由海马区起始，而且其中有一部分，尤其是内嗅皮质，为阿尔茨海默病最先病变的地方。

研究表明，炎症和氧化应激是癫痫和阿尔茨海默病的重要因素［8-11］，贯穿于病情发生发展全过程，而迷迭香酸甲酯具有良好的抗炎、抗氧化应激作用，表明该成分对上述疾病可能有一定作用。另外，迷迭香酸甲酯对脑的影响很复杂，静脉注射后在丘脑、大脑皮层、小脑、下丘脑、纹状体、脑干中也有分布，提示在设计中枢治疗药物时应充分考虑具体的脑核团分布规律，从而得到较好的药效和较低的副作用。因此，动态地观察药物在脑内不同核团中的分布，对于探讨其对脑功能的影响有着重要的理论意义，同时能更好地指导相应药物的开发。