冬瓜皮炭对慢性肾衰竭大鼠肾功能的保护作用

何 勇， 吴荣艳， 刘德慧， 谭 菲*， 彭金亮， 王丽芳， 赖 珺， 张丽慧，刘宏明

（1.赣州市人民医院，江西 赣州341000；2.赣州市第三人民医院，江西 赣州341000）

慢性肾功能衰竭为多种慢性肾脏病缓慢恶化发展的最终结果，由于其临床症状可引发多方面并发症，而且病理基础复杂， 导致死亡率逐年攀升［1-2］，透析清除肾内代谢废物和肾移植可显著降低患者死亡率，延长生命周期，但前者技术复杂，费用高昂，并发症多，次数过于频繁；后者需要等待合适的肾源等［3］。核转录因子信号通路能调控核内相应靶基因进行转录或表达，影响炎症介质合成，诱导炎症反应，导致肾脏损害及肾纤维化，慢性肾功能衰竭大多与肾功能炎症相关，进一步加重衰竭进展。

冬瓜皮具有利尿消肿的功效，用于治疗水肿胀满、小便不利、暑热口渴、小便短赤等症，而且制炭后还增加了吸附清除毒素的功能［4］，并产生部分炭素（即活性炭），但目前相关研究较少［5］。因此，本实验探讨冬瓜皮炭对慢性肾衰竭大鼠的影响，考察其对NF-κB 信号通路激活和抑制途径的干预作用。

1 材料

1.1 药材 冬瓜皮购于赣州益丰大药房医药连锁有限公司，经江西中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为葫芦科植物冬瓜Benincasa hispida（Thunb.） Cogn.的干燥果皮。采用烘箱加热制炭，即将冬瓜皮放到托盘上（平铺1 cm） 置于烘箱中，制炭温度280 ℃，制炭时间15 min，粉碎，取＜80目、＞100 目的细粉，用时加双蒸水配制成3%、4.5%、6%混悬液。

1.2 动物 SPF 级Wistar 雄性大鼠72 只，体质量160～180 g，由南方医科大学动物中心提供，动物使用许可证号SYXK（粤）2016-0167。

1.3 试剂 腺嘌呤（上海索宝科技有限公司，批号A8330），用时加蒸馏水配制成2.5%混悬液，置于4 ℃冰箱中，混匀后使用；肌酐试剂盒（批号D170214）、尿素氮试剂盒（批号L160333） （上海复星长征医学科学有限公司）； TGF-β1、 PAI-1 ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号150321、160088），NF-κB p65 兔抗大鼠一抗（abcam）。爱西特（药用炭片，河北长天药业有限公司，国药准字H13022797）。

1.4 仪器 DHG-9076A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；Bio-Rad 680 酶标仪、PCR 仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；移液器、高速低温离心机（德国Eppendorf 公司）；Labcycler 定量PCR 扩增仪（德国SensoQuest 公司）。

2 方法

2.1 分组及造模 72 只大鼠随机取12 只作为正常组，灌胃给予250 mg／kg 蒸馏水；其余大鼠灌胃给药250 mg／kg 2.5%腺嘌呤混悬液，第1～14 天每天1 次，第15～28 天隔天1 次。第29 天，将造模大鼠随机分为模型组、 爱西特组 （450 mg／kg）及冬瓜 皮 炭 低、 中、 高 剂 量 组 （300、 450、600 mg／kg）。

2.2 给药 造模结束后， 爱西特组大鼠按450 mg／kg剂量灌胃，冬瓜皮炭高、中、低剂量组大鼠分别按600、450、300 mg／kg 剂量灌胃；正常组、模型组大鼠按等体积蒸馏水灌胃，制作大鼠体质量（g） 与给药量（mL） 对照表，每2 d 称1 次体质量，按其变化增减给药量，持续15 d，其间大鼠自由摄食、饮水。

2.3 BUN、Scr、TGF-β1、PAI-1 水平检测 第15天给药1 h 后， 各组大鼠用1%戊巴比妥钠（0.01 mL／g） 麻醉，腹主动脉取血5 mL，3 000 r／min离心15 min，分离血清，按ELISA 试剂盒说明书步骤检测BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平。

2.4 病理形态变化观察 取大鼠肾脏作石蜡切片，分别进行HE 染色（苏木素染色液染色10 min，浸入自来水中洗去多余染色液，约10 min，蒸馏水再洗涤1 次，95%乙醇浸泡5 s，伊红染色液染色2 min）、Masson 染色，光镜下观察大鼠肾组织病理形态变化。

2.5 NF-κB p65、 I-κB mRNA 表达检测 按照RT-PCR试剂盒说明书提取大鼠肾组织总RNA，并将其质量浓度调至1 μg／μL，-80 ℃下保存，引物序列由PrimerPrimier5.0 软件设计，生工生物工程（上海） 股份有限公司合成引物，NF-κB p65 正向5′-TGATGTGCATCTTGAGC-3′， 反 向 5′-GTTGAAGAGAATCGCGTACGC-3′，298 bp； I-κB 正向5′-TGGAGCCGAGGTCAATATAGC-3′， 反 向5′-TGGCACTGTGTACCAGCAAG-3′，320 bp； β-actin 正向 5′-TGCTGAGATTGTGCTGCAGT-3′， 反 向 5′-AGTCAGCTGAGTCGCACTGTT-3′， 290 bp。 采 用SYBR Green 法进行RT-PCR 检测， 反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，59 ℃退火、延伸60 s，40 个循环。以内参β-actin 表达量为参照，进行相对定量分析。

2.6 NF-κB p65 蛋白表达检测 采用Western blot法。将蛋白样品取出后解冻，加入等体积2×SDS上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min 进行变性，加样量为40 μg／孔，经SDS／PAGE 凝胶电泳，电转移至PVDE 膜，封闭，加入一抗（NF-κB p65 抗体稀释1 ∶200），4 ℃下孵育过夜，再与1 ∶10 000 稀释的二抗室温下孵育2 h，显色剂显色1 min，蒸馏水洗涤后保存图像，凝胶图像分析成像系统进行分析。以β-actin 为内参，NF-κB p65 与β-actin 的面积光密度比值表示蛋白表达。

3 结果

3.1 冬瓜皮炭对BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影响 表1 显示，与正常组比较，模型组BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平显著升高 （P ＜0.01）；与模型组比较， 冬瓜皮炭高剂量组BUN、 SCr、TGF-β1、PAI-1 水平显著降低，中剂量组BUN、SCr 水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 冬瓜皮炭对BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影响n＝12）Tab.1 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on BUN，SCr，TGF-β1 and PAI-1 levels，n＝12）

表1 冬瓜皮炭对BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影响n＝12）Tab.1 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on BUN，SCr，TGF-β1 and PAI-1 levels，n＝12）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别 剂量／（mg·kg-1） BUN／（mmol·L-1） SCr／（μmol·L-1） TGF-β1／（pg·mL-1） PAI-1／（pg·mL-1）正常组 — 6.22±1.13 70.83±11.128 51.34±13.02 9.79±1.85模型组 — 28.15±5.11** 171.02±21.33** 120.22±24.03** 22.87±5.81**阳性对照组 450 12.45±2.06＃ 89.41±22.67＃＃ 60.08±1.21＃＃ 10.82±3.51＃＃冬瓜皮炭低剂量组 300 27.31±5.21 160.43±11.81 111.41±23.04 21.42±6.01冬瓜皮炭中剂量组 450 15.86±3.27＃ 93.34±23.42＃ 108.54±24.01 19.98±4.78冬瓜皮炭高剂量组 600 10.01±4.18＃ 86.78±20.32＃＃ 58.09±20.14＃＃ 9.84±1.23＃＃

3.2 大鼠肾组织病理变化 图1 显示，模型组大鼠局灶性间质纤维化，大量炎细胞浸润，肾间质重度纤维化增生，肾小囊腔明显扩张；爱西特组、冬瓜皮炭高剂量组大鼠肾小管轻度扩张，肾小管上皮细胞轻度空泡样变性，肾间质轻度纤维化，肾间质可见少量炎细胞浸润，肾小囊腔轻度扩张，其中后一组囊腔扩张程度更低，组织学变化更少。图2 显示，模型组大鼠肾小管肾间质重度纤维化，扩张肾小管严重；冬瓜皮炭高剂量组大鼠肾间质轻度纤维化，肾小管、肾小囊腔轻度扩张。

3.3 冬瓜皮炭对NF-κB p65、I-κB mRNA 表达的影响 表2 显示，与正常组比较，模型组NF-κB p65、I-κB mRNA 的表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，冬瓜皮炭高剂量组两者mRNA 表达显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 冬瓜皮炭对NF-κB p65、I-κB mRNA 表达的影响（，n＝12）Tab.2 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 and I-κB mRNA expressions（，n＝12）

表2 冬瓜皮炭对NF-κB p65、I-κB mRNA 表达的影响（，n＝12）Tab.2 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 and I-κB mRNA expressions（，n＝12）

注：与正常组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01

组别 （m剂g·量kg／-1） NF-κB p65 I-κB正常组 — 1.00±0.00 1.00±0.00模型组 — 3.55±0.36* 3.27±0.22*阳性对照组 450 1.21±0.02＃ 2.23±0.05＃冬瓜皮炭低剂量组 300 3.45±0.23 3.12±0.13冬瓜皮炭中剂量组 450 3.18±0.14 3.19±0.14冬瓜皮炭高剂量组 600 1.02±0.04＃＃ 1.07±0.11＃＃

图1 各组大鼠HE 染色（×400）Fig.1 HE staining of rats in various groups（×400）

3.4 冬瓜皮炭对NF-κB p65 蛋白表达的影响 表3、图3 显示，与正常组比较，模型组NF-κB p65蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，冬瓜皮炭高剂量组其蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠Massion 染色（×400）Fig.2 Massion staining of rats in various groups（×400）

表3 冬瓜皮炭对NF-κB p65 蛋白表达的影响n＝12）Tab.3 Effect of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 protein expression，n＝12）

表3 冬瓜皮炭对NF-κB p65 蛋白表达的影响n＝12）Tab.3 Effect of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 protein expression，n＝12）

注：与模型组比较，＃P＜0.05

组别 剂量／（mg·kg-1） NF-κB p65正常组 — 0.43±0.02＃模型组 — 1.31±0.01阳性对照组 450 0.59±0.01＃冬瓜皮炭高剂量组 600 0.66±0.02＃

图3 各组NF-κB p65 蛋白表达Fig.3 NF-κB p65 protein expressions in various groups

4 讨论

慢性肾功能衰竭可对肾组织产生漫长性、进行性的实质性、功能性损害，从而导致不同组织、生化、内分泌等全身代谢紊乱组成的临床综合征，具有不可逆转的特征，症状包括肾小球滤过率下降、肾脏代谢发生紊乱，最终诱发终末期肾病和肾功能进一步恶化，患者需要终身依赖肾脏透析或肾脏移植才能获得生存的权利，我国成年人中发病率达10.8%，需要及时预防和诊治［6-7］。

上个世纪七十年代，吸附剂在慢性肾衰治疗中的作用引起了人们重视，相关新型吸附剂的研究也有所进展。其中，爱西特由活性炭制备，主要通过物理作用将病理情况下机体无法排泄、分子量较小的血肌酐、尿素氮等代谢废物进入其孔隙中，经贮存作用使这些物质不留体内循环，减少对肾脏功能损害，最终和爱西特一起排出体外，起到改善初期肾功能病理状态、延缓衰竭进展、降低终末期肾衰竭发生率等作用［8］。临床显示，爱西特能缓解代偿期慢性肾衰竭患者临床症状，降低血肌酐水平，故本实验以爱西特为阳性药。但口服吸附剂存在以下不足：吸附物靶向性差，如活性炭类；吸附容量低，需同时服用几种吸附剂，导致不良反应发生，医疗费用增加；生物相容性较差。因此，设计合成吸附容量高、生物相容性好的复合型口服吸附剂十分迫切。

慢性肾衰竭的主要病理形态为正常肾脏组织结构被成纤维细胞及其分泌的纤维连接蛋白、层粘连蛋白等所替代，肾脏结构受到破坏和侵袭，进而其功能受到损害，不能起到正常代谢作用，逐步丧失排泄废物，维持水电解质、酸碱平衡等正常功能。肾组织纤维化和硬化与TGF-β1、PAI-1 蛋白表达密切相关，前者通过上调DNA 甲基转移酶1 的表达，促使与成纤维细胞的生长相关因子Rasal 1 的DNA 启动子区域形成高甲基化，成纤维细胞失去抑制控制，高甲基化后不断增殖活化；后者在组织内表达的增加能抑制肾组织中纤维蛋白水解，增加纤维蛋白沉积，导致组织器官纤维化加强［9-10］。本实验发现，模型组大鼠体内堆积代谢物BUN、SCr水平显著升高，表明肾脏失去了排泄代谢废物的能力，肾脏功能进一步恶化；TGF-β1、PAI-1 水平显著升高，表明肾脏进一步纤维化和硬化，形成纤维化的病理特征。

氧化应激作用在慢性肾衰竭恶化中起着重要作用，肾小管受到氧化损伤后，当代谢产物堆积、机体氧化应激启动时，活性氧活性增强，促使NF-κB信号途径活化，进而启动肾小管上皮细胞向间充质转化，最后正常上皮细胞失去正常极性，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡、降解细胞外基质的能力等间质表型，纤维化愈加严重，最终导致终末期肾衰竭发生，肾功能完全丧失，故遏制NF-κB 信号通路可减少纤维化的发生［11-12］。NF-κB 的经典激活途径与其蛋白家族中的p65 和p50 有关，只有前者在蛋白的C 末端才含有转录激活区域，故本实验检测其表达以考察激活途径；I-κB 作为细胞内主要抑制NF-κB 表达的因子，通过与NF-κB 二聚体结合来调控NF-κB／I-κB 信号应答，故检测其表达可以了解其抑制途径如何作用；NF-κB 在肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞等细胞中广泛存在，并在肾小球肾炎、肾毒性损害、肾脏疾病等肾脏病理过程中调控TNF-α、IL-1、IL-1β、IFN 等炎症细胞因子产生，在代谢产物堆积后进一步加深氧化应激反应对肾脏的损伤［13-14］。本实验显示，模型组NF-κB mRNA、蛋白表达及I-κB mRNA 表达上调，表明NF-κB 信号通路被激活，肾脏损伤进一步加深，大量肾小管上皮细胞凋亡、坏死、脱落或空泡样变性，高度扩张者与萎缩者并存，肾间质重度纤维化增生， 可见大量炎细胞浸润。

与模型组比较，冬瓜皮炭高剂量组血清尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、TGF-β1、PAI-1 水平明显下降；肾小管轻度扩张，肾间质轻度纤维化，肾小囊腔轻度扩张，肾小球系膜细胞增生不明显，表明它可明显改善肾组织病理形态，恢复正常组织形态；NF-κB p65 亚基mRNA 和蛋白表达显著降低，I-κB mRNA 表达显著下降，与正常组无明显差异，表明它除了起到吸附作用以外，还可通过作用于NF-κB 信号通路来阻断氧化应激对肾脏的刺激作用，维护肾脏正常功能。

综上所述，冬瓜皮炭能明显降低慢性肾功能衰竭大鼠肾脏氮质代谢产物，纠正酸中毒，改善肾脏病理变化，可能与干预NF-κB 信号通路相关。