5-羟色胺转运体基因多态性与AEOPD短期激素干预疗效的关系

胡斯明 徐晓

苏州市立医院呼吸科215000

COPD为临床常见多发慢性呼吸系统疾病，流行病学调查发现近几年其患病率呈上升趋势，中老年人为多发群体，病程较长，病情呈进行性发展，目前发病机制尚未完全清楚[1]。而目前临床上COPD急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)治疗包括糖皮质激素、抗生素、呼吸兴奋剂等，其中糖皮质激素应用较为广泛，可影响多种信号转导与基因表达路径，诱导AECOPD患者体内多种炎症介质水平下降，减轻气道重塑，改善肺功能，降低短期内复发[2]。有报道称药物代谢酶、转运体及药物作用受体的基因多态性与药物治疗个体差异性有关，其中5-羟色胺转运体(5-serotonin transporter，5-HTT)作为一种跨膜转运蛋白，5-羟色胺转运体基因启动子区多态性(5-serotonintransporter-linked promoter region，5-HTTLPR)与5-羟色胺转运体第二内含子多态性(5-serotonin transporter gene 2 VNTR polymorphism，5-HTTVNTR)影响SERT转录活性，可能使不同基因型个体对同一种抗AECOPD药的疗效不同，故对SERT的合成进行编码控制的基因成为研究AECOPD的重要候选基因[3]。目前，关于SERT基因多态性与AECOPD相关性的研究结果不尽相同，而短期激素干预疗效与其关系的研究尚未见报道[4]。因此，本文主要探究SERT基因多态性与AECOPD短期激素干预疗效的关系，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 采用随机平行对照方法纳入2017年1月至2018年1月于苏州市立医院呼吸科收治的68例AECOPD患者为研究对象，开展前瞻性研究，本研究获我院医学伦理委员会批准。纳入标准： (1)符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)诊治中国专家共识(2014年修订版)》[5]中相关诊断标准，均经胸部CT、X线胸片及肺功能等检查确诊为AECOPD，无肺动脉高压；(2)年龄≥42岁，均处于急性加重期；(3)对本研究知情且签署知情同意书。排除标准：(1)合并严重肝肾功能损伤、癌症、肠易激惹综合征、血小板数量或功能异常者；(2)伴肺部器质性病变，如肺结核、支气管哮喘、肺炎等；(3)入选前1个月服用过内皮素受体拮抗剂(波生坦等)、磷酸二酯酶-5抑制剂(西地那非等)或5-HT相关药物；(4)存在精神系统疾病，如躁狂症、抑郁症、孤独症、精神分裂等；(5)存在糖皮激素使用禁忌证者。68例患者中，男46例，女22例，年龄(62.32±5.21)岁，年龄范围为42～74岁。研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.2 研究方法

1.2.1 治疗方法 所有患者均接受常规基础治疗，包括呼吸机锻炼、吸氧、化痰、平喘、抗感染、扩张支气管、纠正酸碱失衡、维持水电解质平衡等。在此基础上所有患者吸入布地奈德福莫特罗粉吸入剂[英国阿斯利康制药有限公司，国药准字H20140458，规格(160μg+4.5μg)/吸]，2次/d，2吸/次，持续3个月。所有受试对象在治疗期内不再使用任何其他糖皮质激素。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 仪器与试剂 仪器包括Alphalmager HP凝胶成像分析系统(Alpha Innotech corp.USA)、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)基因扩增仪2720(美国ABI公司)、TGL-16G台式低温高速离心机(中国上海安亭科学仪器厂)，其他仪器如MDF-382E超低温冰箱、Denver TB-203精密电子天平等均购自中国北京赛多利斯仪器系统有限公司。PCR试剂盒由中国上海生工生物技术服务有限公司生产；DNA快速提取试剂盒由中国天根生化科技(北京)有限公司生产；实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒由中国上海吉玛制药技术有限公司生产；SERT特异性引物序列由中国生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2.2 5-HTT基因多态性检测方法 采集患者外周静脉血3 ml，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，应用全血基因组DNA提取试剂盒(购自中国北京索莱宝科技公司)提取基因组DNA，设计5-HTTLPR引物序列(表1)，行PCR反应。PCR反应条件：94℃5 min预变性，继以94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，共持续35个循环，并以72℃修复延伸7 min后降落至4℃，置入4℃冰箱保存待测。同时，设计5-HTTVNTR引物序列(表1)，行PCR反应。PCR反应条件：94℃5 min预变性，继以94℃变性45 s，60℃退火40 s，72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃修复延伸7 min，置入4℃冰箱保存待测。产物经PCR反应后采用琼脂糖凝胶电泳方法，以3%琼脂糖凝胶、80 V电压电泳40 min，溴乙锭染色后将凝胶电泳图像输入Alphalmager HP凝胶成像分析系统进行分析，鉴定基因型结果。5-HTTLPR基因包括L型(528 bp)、S型(484 bp)。按照条带不同位置，划分为3种类型，即纯合子S/S型、L/L型和杂合子S/L型。5-HTTVNTR基因型包括3种，即10/12、10/10、12/12；存在2个等位基因，即Stin2.10(267 bp)、Stin2.12(301 bp)。

表1 PCR引物设计

1.2.2.3 5-HTT基因表达检测方法 依据RTPCR试剂盒要求，全血提取5-HTT RNA基因、逆转录与PCR扩增。以相对定量方法对比内参样品与样品转录间表达。计算公式：△△Ct=AVERAGE(样本Ct值)-AVERAGE(内参Ct值)。

1.3 观察指标 (1)统计患者基线资料，包括性别、年龄、病程、体质量指数(body mass index，BMI)、体温、血糖、白细胞计数等；(2)观察短期激素干预疗效，按照激素干预疗效，将患者划分为疾病控制组、疾病未控制组。激素干预疗效判定如下。参考相关标准[6]，治愈：咳嗽、咳痰、气促等临床症状完全消失，未出现日间及夜间症状，胸部CT或X线胸片异常影像减少，肺部病变消失，慢性阻塞性肺疾病评估测试(chronic obstructive pulmonary disease assessment test，CAT)评分、第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in the first second，FEV1)基本恢复正常(CAT与治疗前比较降低＞70%，FEV1%pred较治疗前增加＞70%)；显效：临床症状基本消失，影像学检查肺部病变减少，肺功能基本正常，CAT评分、FEV1显著改善(CAT与治疗前比较降低50%～70%，FEV1%pred较治疗前增加≥50%但＜70%)；有效：临床症状有不同程度减轻，肺部病变明显减少，肺功能好转，CAT评分、FEV1改善(CAT与治疗前比较降低30%～49%，FEV1%pred较治疗前增加≥30%但＜50%)；无效：上述临床症状及体征均未达标，或加重。其中，治愈、显效、有效均归入疾病控制组，其余纳入疾病未控制组。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件处理上述数据，以百分率(%)表示计数资料，组间行χ2检验；以±s表示计量资料，组间行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者短期疗效分析 68例AECOPD患者均接受为期3个月的激素治疗后治愈31例，占45.59%；显效20例，占29.41%；有效8例，占11.76%，均归入疾病控制组。无效9例，占13.24%，归入疾病未控制组。

2.2 疾病控制组与疾病未控制组基线资料对比 2组性别、年龄、病程、BMI等基线资料比较差异无统计学意义(P值均＞0.05)，见表2。

2.3 2 组5 -HTTLPR基因型及频率分布 2组患者5-HTTLPR基因型、等位基因频率均符合Hard-Weinberg平衡定律，样本具有群体代表性。疾病控制组S/S基因型频率与S等位基因频率显著高于疾病未控制组(χ2=3.989、5.165，P值均＜0.05)，L等位基因频率显著低于疾病未控制组(χ2=5.165，P=0.023)，见表3。

2.4 2 组5 -HTTVNTR基因型及频率分布 2组患者5-HTTVNTR基因型、等位基因频率均符合Hard-Weinberg平衡定律，样本具有群体代表性。疾病控制组10/10、12/10、12/12基因型频率与10、12等位基因频率较疾病未控制组差异无统计学意 义(χ2=0.149、0.004、0.512、0.007、0.007，P值均＞0.05)，见表4。

表2 疾病控制组与疾病未控制组基线资料对比

表3 2组5-HTTLPR基因型及频率分布[例(%)]

表4 2组5-HTTVNTR基因型及频率分布[例(%)]

2.5 2 组5 -HTTLPR、5-HTTVNTR基因表达水平比较 疾病控制组5-HTTLPR m RNA表达显著低于疾病未控制组(t=2.249，P=0.027)，5-HTTVNTR m RNA表达较疾病未控制组差异无统计学意义(t=1.835，P=0.071)，见表5。

表5 2组5-HTTLPR、5-HTTVNTR基因表达水平比较(±s)

表5 2组5-HTTLPR、5-HTTVNTR基因表达水平比较(±s)

注：5-HTTLPR为5-羟色胺转运体基因启动子区多态性；5-HTTVNTR为5-羟色胺转运体基因第二内含子多态性

组别 例数5-HTTLPR mRNA 5-HTTVNTR mRNA疾病控制组 59 0.000 18±0.000 17 0.000 17±0.000 13疾病未控制组 9 0.000 32±0.000 20 0.000 26±0.000 18 t值 2.249 1.835 P值 0.027 0.071

3 讨论

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)属于一种血管活性物质，有报道称其与肺部炎症反应及肺动脉高压的形成有关[7]。动物实验发现，使用5-HT再摄取抑制剂可降低AECOPD大鼠肺动脉压，抑制肺组织炎症反应[8]。冯喜英和陈婧[9]表明AECOPD患者血小板会大量释放存贮的5-HT，引起血小板内5-HT浓度下降，其降低幅度与肺动脉高压严重程度有关。所以，目前诸多学者认为5-HT在AECOPD发生发展中占据着重要作用[10-11]。5-HT经与肺血管平滑肌细胞上的5-HTT转运，引起血管平滑肌细胞增殖。而5-HTT基因位于染色体17q11.1～12区域，长35 kb，存在14个内含子、2个常见多态性(5-HTTLPR、5-HTTVNTR)，能诱导效应部位过多聚集的5-HT再摄取，终止5-HT作用，帮助合成新的5-HT提供底物[12]。近年来，有研究发现5-HTT基因多态性与肠易激惹综合征、精神系统疾病(如孤独症、抑郁症等)、呼吸系统疾病(如肺动脉高压、AECOPD等)等有关，但国内关于5-HTT基因多态性与AECOPD的相关性报道较少，尤其是其与AECOPD短期激素干预疗效之间的关系未见报道[13]。因此，笔者对此进行了探讨。

本研究结果显示，疾病控制组5-HTTVNTR基因型及频率分布较疾病未控制组差异无统计学意义，但S/S基因型频率明显高于疾病未控制组，提示拥有S/S基因型的AECOPD患者短期激素干预疗效较好。但有研究表示，“S”等位基因与药物起效慢、疗效差相关，而“L”等位基因与药物起效快、疗效好密切相关[14]。朱晓昱等[15]表示，与具有“S”等位基因的单相抑郁患者比较，具有“L”等位基因的单相抑郁患者对安慰剂和氟西汀的疗效均较好。Yang等[16]认为具有“L”基因型的单相抑郁患者服用氟西汀4周后疗效较好。但国外诸多国家(如韩国、日本等)的研究结果与上述结果相反。Santangelo等[17]发现“S/S”基因型患者对氟西汀及帕罗西汀疗效较好。Miller等[18]发现5-HTTVNTR多态性与氟伏沙明疗效无明显关联。而本文发现，5-HTT基因多态性影响AECOPD短期激素干预疗效，主要表现为S/S基因型疗效均优于L/L基因型。笔者推测，具有S/S基因型的AECOPD患者5-HTT蛋白呈低表达，5-HT大量堆积，促使5-HT4受体出现适应性下调或去敏感现象，这可能与药物疗效相关；而激素干预后，与5-HT4受体结合，促使受体状态与敏感性改变，导致堆积在效应部位的5-HT能发挥效能；而L/L基因型高表达5-HTT蛋白，导致血小板大量释放存贮的5-HT，促进AECOPD形成，促使效应部位5-HT被超前摄取，减少了5-HT与5-HT4受体及5-HT1P受体的结合，诱导5-HT受体适应性上调，或其敏感性增加，很大程度上降低了激素干预疗效。动物实验表现，尽管糖皮激素能高效结合5-HT4受体，但L/L基因型的高表达可能会部分抵消糖皮激素的生物学效应，影响其药物疗效，这与本文研究结论相似[19]。

本研究结果显示，疾病控制组5-HTTLPR基因表达水平明显低于疾病未控制组，5-HTTVNTR基因表达较疾病未控制组无明显变化，证实短期激素干预能有效降低5-HTTLPR基因表达。究其根源，AECOPD炎症性病理改变诱导5-HT大量被释放，促使5-HTTLPR基因表达水平增加；而短期激素干预能调节5-HT系统功能，促使5-HT受体适应性下调，一定程度上增加了其敏感性，进而对血小板5-HTT表达有抑制作用[20]。本研究虽证实5-HTT基因多态性与AECOPD短期激素干预疗效之间存在一定关系，但由于人种及地域的不同可能会使得基因型分布有所不同，从而使药物疗效出现差异，这是否与药物代谢方面及药物敏感性方面的种族差异有关尚需进一步验证。另外，本研究样本量偏小，可能存在抽样误差，故以后研究中需增加样本量深入探讨。

综上，5-HTTLPR及5-HTTVNTR两种基因多态性与AECOPD短期激素干预疗效之间有关联，临床应引起足够重视。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突