支气管哮喘患者的血清分泌型卷曲相关蛋白5与其气道炎症的相关性分析

廖正寿 陈东华 鲁潜乾 张志军 罗小春

深圳市宝安区沙井人民医院急诊科518104

支气管哮喘(哮喘)是常见的呼吸道慢性炎性疾病之一，对其发病机制尚未完全阐明，主要表现为在发病时由肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞等多种细胞参与的气道炎症[1-2]。其易感者主要表现为反复咳嗽、喘息和/或气促等症状，大部分在夜间或早晨发生，症状可自行或经治疗后缓解[3]。目前全世界约有一亿哮喘患者，我国哮喘的患病率约为1%，其中儿童可达3%，已成为严重威胁公众健康的一种慢性疾病[4-5]。因哮喘是一种气道炎症，故监测气道炎症对其诊断、治疗及预后评估具有重要意义。分泌型卷曲相关蛋白5(secreted frizzled-related protein 5，SFRP5)是一种由脂肪细胞分泌的抗炎因子，可通过Wnt信号通路介导转化生子因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和IL-13等炎性因子的低表达来实现抗炎作用[6]。研究发现，“细胞炎性因子网络失衡”在哮喘的发病过程中发挥重要作用，TGF-β1、IL-13和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是主要的炎性因子，可能参与了哮喘发作[7]。目前，SFRP5与哮喘的关系尚不清楚，我们推测，SFRP5可能在巨噬细胞参与下发挥抗炎作用。因此，本研究通过观察哮喘SFRP5水平的变化及分析与气道炎症的关系，初步探讨SFRP5在哮喘疾病发生、发展过程中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年11月至2018年9月在广东省深圳市宝安区沙井人民医院诊治的哮喘患者96例，年龄(40.15±9.35)岁，年龄范围为20～63岁；其中将哮喘急性发作48例作为急性组，男34例，女14例，年龄(39.85±9.21)岁，年龄范围为20～62岁；将哮喘缓解者48例作为缓解组，男36例，女12例，年龄(40.46±9.52)岁，年龄范围为22～63；选择同时期在广东省深圳市宝安区沙井人民医院进行健康体检者48例作为正常对照组，男32例，女16例，年龄(41.03±10.51)岁，年龄范围为22～60岁。3组患者基线水平具有可比性。又将急性组分为轻度急性组28例和中重度急性组20例。所有患者均按照《支气管哮喘防治指南(2016年版)》[8]进行治疗。病例入选标准：(1)哮喘诊断符合《支气管哮喘防治指南》(2016年版)；(2)能完成肺功能检查；(3)纳入试验前6周没有接受激素或抗生素治疗；(4)征得研究对象及家属知情同意，签署知情同意书。病例排除标准：(1)有支气管扩张、COPD、肺结核等肺部结构性改变；(2)患有冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压、糖尿病等疾病；(3)患有急慢性肝肾疾病；(4)患有神经精神系统疾病或其他系统感染性疾病。本研究获得医院医学伦理委员会批准(伦审2016-13号)。

1.2 样本采集和生化指标的检测

1.2.1 样本采集 采集受试者清晨空腹静脉血5 ml，用枸橼酸钠抗凝，离心分离血清，分装后-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 血清指标检测 采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)法(试剂盒购于中国上海酶联生物科技有限公司)检测血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平。将相应一抗稀释至10 mg/L，加入到96孔板中，0.1 ml/孔，4℃过夜，洗涤3次，加血清0.1 ml于上述反应孔中，37℃孵育1 h；加入新配置相对应的二抗0.1 ml，孵育1 h；加入新配置的3，3′，5，5′-四甲 基 联 苯 胺(TMB)底 物 溶 液0.1 ml，显色20 min；加入2 mol/L硫酸0.05 ml终止反应，于450 nm处测各孔吸光度(A)值。

1.2.3 肺功能检测 测定第1秒用力呼气容积占预计值百分比(forced expiratory volume in one second as a percentage of expected value，FEV1%pred)、FVC，FEV1/FVC。

1.3 统计学分析 用SPSS 21.0对数据进行录入、统计学分析。实验结果采用±s，采用t检验和单因素方差分析进行判断，多重比较采用SNK-q检验；相关分析采用Pearson积差相关，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组人群血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的比较 缓解组和急性组SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于对照组，差异有统计学意义(F=38.24、5.81、3.54，P值均＜0.05)；急性组SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于缓解组，差异有统计学意义(t=9.842、25.199、6.265，P值均＜0.05)；缓解组和急性组TGF-β1、IL-13和TNF-α水平均高于对照组，差异有统计学意义(F=41.53、8.37、63.84，P值均＜0.05)；急性组TGF-β1、IL-13和TNF-α水平均高于缓解组，差异有统计学意义(t=15.365、16.236、19.040，P值均＜0.05)。见表1。

2.2 病情严重程度对血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的影响 中重度急性组SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于轻度急性组，差异有统计学意义(t=3.96、30.62、24.96，P值均＜0.05)；中重度急性组TGF-β1、IL-13和TNF-α水平均高于轻度急性组，差异有统计学意义(t=5.08、7.47、9.58，P值均＜0.05)。见表2。

2.3 哮喘患者血清中SFRP5水平与TGF-β1、IL-13、TNF-α水平、肺功能及病情的相关性分析 哮喘患者血清中SFRP5水平与TGF-β1、IL-13和TNF-α呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.459、-0.518、-0.642，P值均＜0.05)；与FEV1%pred、FEV1/FVC和病情呈正相关，差异有统计学意义(r=0.452、0.4788、0.472，P值均＜0.05)。见表3。

3 讨论

哮喘是由免疫损伤引起，细胞因子的种类决定其发展和转归。研究证实，炎症既参与气道炎症，也决定了肺功能的转归，TGF-β1、IL-13、CRP三者参与了哮喘的发病过程[9]。TGF-β1兼具抗炎和促进炎症作用，可以延长Th2细胞的存活期而增加IL-13、IL-4等细胞因子，同时也能抑制Th2细胞的活性减少IL-13的作用，但促进IL-13增加的作用远大于其抑制作用，引起血清中IL-13水平升高，对气道炎症的形成及加重发挥调节作用[10-11]。IL-13是由Th2细胞分泌、具有多种功能的细胞因子。目前，IL-13被认为是引起哮喘发病的关键细胞因子，是哮喘发病的中心环节。主要表现在两方面，首先，IL-13通过激活嗜酸粒细胞，促进IgE的生成和释放，诱发气道高反应性；其次，IL-13能直接刺激成纤维细胞的增殖及活化，引起气道变窄及呼吸道重塑[12]。IL-13可以单独作用引起哮喘发作，通过哮喘模型，在小鼠体内预先注入一定量的anti-IL-13，发现气道炎症明显减少，小鼠哮喘症状也减轻[13]。TNF-α主要由单核巨噬细胞分泌，其水平增加可激活核因子-κB下游的其他细胞因子，增强细胞内炎症信号的强度[14]。本研究结果显示，当发生哮喘时，血清中TGF-β1、IL-13、TNF-α水平显著增高，并与病情严重程度有关。

表1 3组人群血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的比较(±s)

表1 3组人群血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的比较(±s)

注：SFRP5为分泌型卷曲相关蛋白5；TGF-β1为转化生子因子β1；TNF-α为肿瘤坏死因子α；FEV 1%pred为第1秒用力呼气容积占预计值百分比；与对照组比较，a P＜0.05

组别 例数 SFRP5(μg/L)TGF-β1(ng/L)IL-13(ng/L) TNF-α(ng/L)FEV 1%pred(%)FEV 1/FVC(%)对照组 48 13.42±1.63 311.94±30.42 21.68±2.78 98.47±14.36 91.34±5.37 85.47±3.15缓解组 48 9.78±1.60a 479.52±71.46a 42.73±8.19a 221.83±52.16a 85.73±6.30a 73.72±4.69a急性组 48 6.39±0.51a 734.71±90.19a 69.25±7.81a 438.25±59.00a 50.41±7.39a 65.95±7.20a F值 38.24 41.53 8.37 63.84 5.81 3.54 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.01 0.03

表2 病情严重程度对血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的影响(±s)

表2 病情严重程度对血清中SFRP5、TGF-β1、IL-13和TNF-α水平及肺功能的影响(±s)

注：SFRP5为分泌型卷曲相关蛋白5；TGF-β1为转化生子因子β1；TNF-α为肿瘤坏死因子α；FEV 1%pred为第1秒用力呼气容积占预计值百分比；与轻度急性组比较，a P＜0.05

组别 例数 SFRP5(μg/L)TGF-β1(ng/L)IL-13(ng/L) TNF-α(ng/L)FEV 1%pred(%)FEV 1/FVC(%)轻度急性组 28 7.35±0.80 679.52±59.63 61.66±7.48 318.83±52.70 64.70±8.53 70.55±6.36中重度急性组20 5.38±0.41a 850.52±95.62a 84.64±9.05a 562.98±63.91a 45.82±5.51a 52.89±9.47a t值 3.96 5.08 7.47 9.58 30.62 24.96 P值 0.02 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 哮喘患者血清中SFRP5水平与TGF-β1、IL-13、TNF-α水平、肺功能及病情的相关性分析

SFRP5是SFRP家族中的一员，SFRP5基因定位于人染色体10q24.1上，含有一个细胞外富含半胱氨酸结构域(cysteine-rich domain，CRD)，该结构域与Wnt信号通路的跨膜受体卷曲蛋白(Frizzled，Frz)的CRD具有高度的同源性，与Frz竞争性结合Wnt配体，抑制Wnt信号通路[15]。Wnt信号通路通过调控T细胞、B细胞及巨噬细胞等多种免疫细胞的分化与发育，在机体免疫应答过程中发挥重要作用[16]。SFRP5广泛表达于脂肪和肺等组织，通过抑制脂肪组织中巨噬细胞分泌促炎因子如TNF-α和IL-13等，而发挥抗炎功能[17]。研究发现，人体内Wnt由脂肪组织中的巨噬细胞表达，作为促炎分子参与了炎症的发生、发展过程[18]。SFRP5是Wnt的抑制剂，通过抑制非经典Wnt通路的下游靶点c-Jun氨基末端激酶-1(c-Jun N-terminal kinases-1，JNK-1)的活性，减少炎症因子的分泌。在对风湿性关节炎患者的研究中发现，SFRP5通过下调JNK-1，可以抑制IL-6和IL-1β释放[19]。在高脂喂养条件下，SFRP5基因缺陷小鼠TNF-α和IL-1β水平显著高于野生型小鼠，同时，白色脂肪组织中JNK-1的磷酸化以及JNK-1下游底物c-Jun的磷酸化均明显提高[20]。提示SFRP5基因沉默可以活化JNK-1，增加TNF-α和IL-1β水平，解除SFRP5对Wnt-JNK信号通路的抑制作用，产生炎症作用。本研究结果显示，缓解组和急性组SFRP5、FEV1%pred和FEV1/FVC均低于对照组，且急性组SFRP5低于缓解组；中重度急性组SFRP5低于轻度急性组；哮喘患者血清中SFRP5水平与TGF-β1、IL-13和TNF-α呈负相关；与FEV1%pred、FEV1/FVC和病情呈正相关。

综上所述，SFRP5与气道炎症呈负相关，与肺功能和病情呈正相关，SFRP5作为一种抗炎因子，对哮喘患者病情严重程度及预后判断、治疗具有重要意义。通过沉默SFRP5基因可能为哮喘的治疗提供一个新的思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突