瓜蒌薤白汤对博来霉素致大鼠肺纤维化内质网应激反应的影响

林家猛，李立华

(1.云南省玉溪市中医院药学部，云南 玉溪 653100； 2.安徽中医药大学第一附属医院药学部，安徽 合肥 230031)

肺纤维化在临床上被称为“间质性肺炎”，其初期病理特征主要表现为各类急性炎症，学术界对其发病机制尚未有共识[1-2]。在中国，肺纤维化的发病率呈现逐年上升的趋势。目前临床上多采用免疫抑制药和肾上腺皮质激素治疗肺纤维化，但该治疗方案可造成继发感染，且不良反应较为严重[3]。汉代名医张仲景《金匮要略》中的经典方剂——瓜蒌薤白汤，在临床上治疗胸痹取得了良好的疗效[4]。笔者的前期研究显示，其对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化具有一定的治疗效果，但尚未对其治疗机制进行相应的研究。本研究将探讨瓜蒌薤白汤对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠内质网应激反应的影响，从而初步明确其对肺纤维化的干预机制，为其临床应用提供理论基础。

1 材料

1.1 实验动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠40只，购于安徽医科大学实验动物中心[动物生产许可证号为SCXK(皖)2011-002，动物使用许可证号为SYXK(皖)2011-007]，体质量160～200 g，周龄6～7周，所有大鼠均不带有人兽共患病原、烈性传染病病原、常见传染病病原及对动物危害大和对研究干扰大的病原，且所有大鼠具有相同遗传背景。实验前对其进行1周的适应性喂养，保证大鼠可自由进食、饮水，维持正常的昼夜规律，设置环境湿度50%左右，温度24 ℃左右。大鼠所用饲料为标准饲料，由安徽中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验用药 强的松(批号 110465)由浙江仙琚制药股份有限公司生产；瓜蒌(批号20121103)、薤白(批号 20121015)均由深南中药饮片公司提供，购入后均由安徽中医药大学第一附属医院主任中药师李立华进行相应鉴定，鉴定标准参考《中华人民共和国药典》2015年版。瓜蒌薤白汤是通过正交试验验证的提取方案获得的浓缩醇提取物。临用时由生理盐水配成使用浓度。

2 方法

2.1 动物分组及模型复制 结束适应性饲养后，将大鼠随机分成正常对照组、模型组、阳性对照组(按照3.6 mg/kg的剂量给予强的松)、瓜蒌薤白汤组(按照2.8 g/kg的剂量给予瓜蒌薤白汤)，每组10只。实验中的药物剂量均参考人体正常用药量和人与大鼠体质量的比例计算获得。将4组大鼠通过腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，并完成气管插管，其中模型组、阳性对照组、瓜蒌薤白汤组按照5 mg/kg的剂量注射博来霉素复制肺纤维化模型，正常对照组则根据大鼠体质量注入同等容积的生理盐水。隔日对阳性对照组和瓜蒌薤白汤组通过灌胃给予相应的治疗药物，正常对照组、模型组则根据大鼠体质量给予同等容积的生理盐水灌胃，各组每日灌胃1次，每周均根据大鼠的体质量变化对用药量进行相应的调整，给药持续28 d。一般20 d后便可取出大鼠肺组织进行检测，当支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)细胞数量和胶原蛋白的沉积明显增高时可视为模型复制成功。

2.2 大鼠生理指标及肺组织病理检测 第28天麻醉大鼠后选择股动脉放血法处死大鼠。及时取出各组大鼠肺组织，并称质量和观察大体形态，统一留取各组大鼠左下肺组织置于4%多聚甲醛溶液中固定。将剩下的肺组织保存于-80 ℃的冰箱中，以备其他指标的检测。肺系数=肺湿质量/体质量。取经过固定的肺组织，依据病理学方法步骤进行脱水、包埋、切片等操作，分别行Masson和苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。根据Szapiel等[5]的方案对大鼠进行肺炎症状评分，选择单盲法于各组样本中随机选取8个视野观察肺泡炎症并分级，0级计1分，1级计2分，2级计3分，3级计4分。具体评级标准见表1。

依据Ashcroft等[6]的方案对肺纤维化症状进行评分，选择单盲法于各组样本中随机选取8个视野观察肺泡纤维化程度并分级。具体评级标准见表2。0级计1分，1级计2分，2级计3分，3级计4分，每组8个样本分别评分，并计算平均值。

2.3 免疫组织化学法检测内质网应激相关蛋白表达水平 取经多聚甲醛固定的肺组织切片后脱蜡，进行抗原修复，滴加磷酸化蛋白激酶RNA样内质网激酶(phospho-protein kinase RNA-like ER kinase，p-PERK)、磷酸化肌醇蛋白酶1α(phospho-inositol-requiring enzyme 1α，p-IRE1α)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)或激活转录因子6α(activating transcription factor 6α，ATF6α)抗体(按照1∶80进行配制)，孵育时放置于4 ℃环境中过夜。通过DAB进行显色，接着使用苏木精进行复染，随机取各切片中的200倍视野10个，从各组随机选取切片4张，图像采集选择Olympus公司图像采集系统，半定量分析则通过Image-Pro Plus图像分析软件进行，目的蛋白表达的计算选择积分光密度(integral optical density,IOD)与面积比值法。

表1 肺炎症状评级标准

表2 肺纤维化症状评级标准

3 结果

3.1 各组大鼠肺的大体形态学变化和肺系数比较 正常对照组大鼠的肺脏为粉红色，外观基本正常，肺泡壁弹性正常且光滑；模型组大鼠肺颜色较暗，部分可呈现灰白色，存在分布均匀的点状瘀血斑；阳性对照组与瓜蒌薤白汤组大鼠肺颜色较模型组红润，可见少量灰白色部位和点状瘀血斑。模型组大鼠的肺系数相较于其他3组均明显增加(P<0.05)；且阳性对照组的肺系数显著高于瓜蒌薤白汤组大鼠(P<0.05)。见表3。

3.2 各组大鼠肺组织形态学变化比较 HE染色后光镜下发现，正常对照组大鼠肺泡壁较薄，具有完整的肺泡结构，未发现炎症细胞浸润或充血等情况；模型组大鼠肺泡壁变厚，众多肺泡出现塌陷，部分可见融合成大肺泡，肺泡中具有明显的炎症细胞浸润或充血等情况；阳性对照组与瓜蒌薤白汤组大鼠的炎症程度相较于模型组显著减轻(P<0.05)；阳性对照组与瓜蒌薤白汤组大鼠的肺仍可保持肺泡结构，但肺泡间隔存在局部变厚，肺泡较少存在融合。见表3、图1。Masson染色后光镜下发现，正常对照组大鼠具有完整肺泡结构，无蓝色胶原在肺泡间隙沉积；模型组大鼠双肺丧失了绝大部分肺泡结构，可见蓝色胶原大量沉积于间质，肺部实变，其纤维化程度相较于阳性对照组和瓜蒌薤白汤组大鼠明显增加(P<0.05)；阳性对照组与瓜蒌薤白汤组大鼠肺泡间隔的胶原沉积情况较轻，其纤维化程度与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图1。

图1 各组大鼠肺脏组织形态学变化比较(10×10倍)

组 别n肺系数/(g/g)炎症程度评分纤维化程度评分正常对照100.004 1±0.000 1∗1.12±0.08∗0.16±0.03∗模 型100.005 8±0.000 23.47±0.296.55±0.71阳性对照100.004 6±0.000 2∗1.58±0.13∗0.11±0.02∗瓜蒌薤白汤100.004 3±0.000 1∗#1.62±0.18∗0.17±0.09∗

注：与模型组比较，*P<0.05，与阳性对照组比较，#P<0.05

3.3 各组大鼠肺组织内质网应激相关蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和瓜蒌薤白汤组大鼠肺组织中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，瓜蒌薤白汤组大鼠肺组织中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表4。

4 讨论

细胞外基质的异常沉积导致的肺组织结构被取代和肺成纤维细胞聚集是肺纤维化的重要病理特征[7]。目前，与人类肺纤维化病理学变化相似度最高的模型是博来霉素诱导的大鼠肺纤维化。前期的文献研究显示，肺纤维化在博来霉素经气管注入大鼠后14 d就可形成[8]。而强的松作为临床上广泛使用的糖皮质激素，可以控制肺纤维化，在药理学研究中也可用作抗肺纤维化药物筛选的阳性对照药。本研究中，模型组大鼠肺组织病理结果显示大鼠肺泡壁变厚，众多肺泡出现塌陷，部分可见融合成大肺泡，肺泡中具有明显的炎症细胞浸润或充血等情况，而Masson染色结果则显示蓝色胶原大量沉积于间质，肺部实变。以上证据都表明博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型复制成功。而瓜蒌薤白汤对于博来霉素造成的炎症反应可发挥较好的治疗效果，同时可改善纤维化程度和蓝色胶原在肺泡间隙沉积，提示瓜蒌薤白汤对博来霉素所致大鼠肺纤维化具有较好的治疗效果。

图2 各组大鼠肺组织内质网应激相关蛋白表达情况(免疫组织化学法，10×10倍)

组 别np-PERKp-IRE1αGRP78ATF6α正常对照100.005 5±0.002 3∗0.007 2±0.006 8∗0.015 7±0.004 8∗0.006 4±0.002 5∗模 型100.031 4±0.011 30.033 1±0.010 90.035 2±0.009 60.026 3±0.005 3阳性对照100.006 7±0.001 2∗0.009 7±0.007 3∗0.016 9±0.007 4∗0.008 2±0.003 5∗瓜蒌薤白汤100.007 1±0.001 8∗0.009 5±0.005 9∗0.017 5±0.008 3∗0.009 1±0.004 2∗

注：与模型组比较，*P<0.05

瓜蒌薤白汤作为临床应用中的经典方剂，其适应证主要有胸背彻痛、喘息咳唾、短气等，对于胸痹具有显著的疗效[9]。该方的组成为薤白和瓜蒌，其中瓜蒌主要发挥涤痰散结、理气宽胸的作用；薤白则发挥通阳散结、温通滑利、行气止痛之功效，经过配伍后可发挥保护缺血心肌，抗低氧及阻止血小板的聚集等作用[10-11]。对于瓜蒌薤白汤的研究重点目前主要集中在药理活性及临床应用方面，而对其发挥作用的相关机制研究较少[12]。

为进一步确定瓜蒌薤白汤对大鼠肺纤维化发挥治疗作用机制，笔者通过免疫组织化学法对模型组和瓜蒌薤白汤组大鼠肺组织中内质网应激相关蛋白的表达进行检测。结果显示模型组大鼠肺组织中p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表达水平相较于正常对照组大鼠显著升高，而经过瓜蒌薤白汤干预后p-PERK、p-IRE1α、GRP78和ATF6α的表达水平显著降低。内质网作为真核生物中的细胞器，其主要在合成脂类、蛋白质折叠及生成糖原等多方面发挥重要影响[13]。当机体出现氧化应激、化学损伤及营养缺乏等因素刺激后，内质网的相关功能均会受到影响，造成内质网腔内未折叠及错误折叠的蛋白质蓄积而引发内质网应激[14]。越来越多的文献报道显示内质网应激参与肺纤维化的发病过程中[15]。内质网应激可作用于PERK、ATF6及IRE1等相关通路，进而促进细胞凋亡、刺激炎症反应等促进肺纤维化的发生发展[16]。当内质网的分子伴侣GRP78结合内质网应激的未折叠蛋白中ATF6、PERK和 RE1 3个跨膜蛋白，此时细胞可处在稳定状态，当受到相关刺激时，其原本的结合状态会出现解离，从而使未折叠蛋白的3条通路被激活，未折叠蛋白作为内质网应激的敏感蛋白，发生反应后其表达可发生上调[17]。内质网应激可以通过激活ATF6、PERK和IRE1 3条通路引起炎症反应、细胞凋亡及上皮-间质转化进而导致肺纤维化的形成。本实验结果表明，模型组大鼠GRP78呈现高表达，而经过瓜蒌薤白汤干预后GRP78的表达受到抑制。当发生内质网应激反应时跨膜蛋白PERK的激活通过磷酸化进行，进而磷酸化eIF2α，最终活化核因子κB引发炎症反应[18]。本实验结果显示，瓜蒌薤白汤可显著抑制博来霉素激活的PERK磷酸化程度。IRE1α主要作用于c-Jun氨基末端激酶信号通路来引发炎症及凋亡反应[19]。本实验结果同样表明，瓜蒌薤白汤可显著抑制博来霉素激活的IRE1α磷酸化程度。活化的ATF6作用于P38，进而导致炎症反应。研究结果显示，经瓜蒌薤白汤干预后，ATF6α的表达水平相较于模型组显著降低。综合本实验结果，提示瓜蒌薤白汤可显著抑制博来霉素激活的内质网应激反应的3条通路。文献报道显示，内质网应激作用于未折叠蛋白反应的3条通路，可导致炎症反应，同时内质网应激也可导致氧化应激和细胞凋亡等[20]。

综上所述，本研究结果表明，瓜蒌薤白汤治疗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化可能与抑制内质网应激有关。总之，通过瓜蒌薤白汤对肺纤维化大鼠的治疗作用及可能机制的研究，为其临床治疗肺纤维化提供了新的证据。