国家标准方法测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留量检测方法的改进

宋 瑞，李 云，赵义良，田 梅，王志恒，何立宁

(石家庄市畜产品质量监测中心，石家庄 050041)

硝基呋喃类药物对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌、真菌、原虫等病原体有很好杀灭作用，是一种广谱抗生素。硝基呋喃类药物常用的是以下4种:呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因。此4种药物使用后在生物体内代谢迅速，其代谢产物分别为AMOZ、AOZ、SEM、AHD。因价格低且疗效好，硝基呋喃类药物广泛应用于水产养殖业。但是，硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用。我国农业农村部已发布公告在饲养过程中禁止使用硝基呋喃类药物[1]，且在动物性食品中不得检出硝基呋喃类药物代谢物。农业部783-1-2006号公告[2]实现了水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的检测工作从无方法、无标准到有国家检测方法的革新，并且能够指导基层工作者进行这项检测工作。其原理是将样品肌肉组织残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下水解衍生化，经液液萃取后，氮气吹干、甲醇溶液溶解，内标法定量。由于其中部分检测过程不完善，会产生水解衍生化不彻底，液液萃取离心后，分层明显，保留层较浑浊。氮气吹干后，由于有油脂存在，涡旋离心后会产生严重乳化现象，使得标准曲线线性不理想。通过改变衍生化环境、调节离心转速以及定容后涡旋转速，较好的解决了上述问题，获得较好的标准曲线。做2.5 ng/g阳性添加后，回收率可以达到95%以上。检测的灵敏度可达0.1 ng/g。方法改进后提升了准确度、精密度、灵敏度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 AB SCIEX 5500超高效液相色谱串联质谱仪；ZORBAX SB C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色谱柱；甲醇为色谱纯；盐酸为优级纯；磷酸氢二钾为分析纯；2-硝基苯甲醛(购自德国CNW公司)；标准品AMOZ(WITEGA公司，纯度99.9%，批号C010MGNF003)、AOZ(WITEGA公司，纯度99.1%，批号C010MGNF005)、SEM(Dr.公司，纯度99.8%，批号G151417)、AHD(Dr.公司，纯度99.3%，批号G138075)；同位素内标标准品AHD-13C3(WITEGA公司，纯度99.1%，批号957509-21-8)、AOZ-D4(WITEGA公司，纯度99.2%，批号1188331-23-8)、AMOZ-D5(WITEGA公司，纯度99.6%，批号1017793-94-0)、SCA-HCI-13C,15N2(WITEGA公司，纯度99.8%，批号1173020-16-0)。

1.2 试剂配制 5 mmol乙酸铵溶液0.385 g醋酸铵定溶于1000 mL水中,冰乙酸调节pH值至4.5；5%甲醇溶液：甲醇+水=5+95(V/V)；0.2 mol/L盐酸溶液：浓盐酸1.6 mL，用水稀释至100 mL；0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：称取0.0378 g 2-硝基苯甲醛，溶于5 mL 二甲亚砜中，现用现配；1 mol/L磷酸氢二钾溶液：三水磷酸氢二钾114.11 g，溶于500 mL水中[3]。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件 流动相：A相(5 mmol乙酸铵溶液，pH=4.5)+B相(0.1%甲酸乙腈)，流速：0.30 mL/min[4]，梯度如表1所示。

表1 流动相梯度Tab 1 Flow phase gradient

1.3.2 质谱条件 离子源：ESI源，正离子模式；IS电压：5500 V；气帘气CUR：20 psi；雾化气GSI：50 psi；辅助气GS2：60 psi；源温度TEM：550 ℃；碰撞气CAD：9 psi，4种硝基呋喃代谢物及其内标的定性、定量离子对、同位素化合物碎裂电压、碰撞能量如表2、表3所示。

表2 4种硝基呋喃代谢物的定性、定量离子对、同位素化合物碎裂电压、碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pairs, fracture voltage and collision energy of 4 nitrofuran metabolites

表3 4种硝基呋喃代谢物内标的定性、定量离子对、同位素化合物碎裂电压、碰撞能量Tab 3 Qualitative and quantitative ion pairs,fracture voltage and collision energy of 4 nitrofuran metabolites

1.4 实验方法

1.4.1 标准曲线的配制 分别准确移取10 ng/mL 混合标准工作溶液0.025、0.05、0.10 mL和100 ng/mL混合标准工作溶液0.025、0.05、0.10 mL于50 mL离心管中，除不加样品外，按提取与净化步骤进行操作[5]。

1.4.2 样品制备、提取与净化 试样制备，检测样品为市场监督抽检鲤鱼一尾(被抽样单位佳农市场，产地行唐县)，去鳞、去皮，切下脊背肉。磨碎[6]，匀浆，作为检测试样，同时也当空白试样，多称取2份样品，加入适宜的标准溶液，作为阳性添加试样[7]。

称取试样2.0 g，置于50 mL的离心管中，加入50 μL(100 ng/mL的混合内标工作液)。涡旋混合[8]50 s，加入5 mL盐酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋50 s，37度恒温振荡16 h。取出离心管后放置至室温[9]，加入4 mL浓度为1 mol/L的磷酸氢二钾溶液，调节pH=7.0～7.5，(此处pH都在范围内，不用调)，加入4 mL乙酸乙酯，涡旋振荡50 s，10000 r/min离心5 min。取上清液转移至另一15 mL离心管中[10](分4层，取最上层)；再加入4 mL乙酸乙酯，涡旋振荡50 s，10000 r/min离心5 min，合并有机相，40 ℃下氮气吹干。准确加入1 mL甲醇溶液[11]，使用IKA涡旋混合仪，涡旋速度低于500 r/min,15 s,取上清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定[12]。

2 结果与分析

2.1 衍生化过程 783号公告酸性环境用0.6 mL浓盐酸加入100 mL水中，再加入2-硝基苯甲醛。实验发现衍生化效果并不好，回收率较低，标准曲线线性不好。主要原因是浓盐酸量较少。浓盐酸使用量增大至1.6 mL[13]，回收率有明显的提升。由图1可见提升浓盐酸浓度后，标准曲线线性得到明显改善。衍生化后的pH值经比对，783号公告pH=1.18±0.02，方法改进后pH=0.95±0.02。

783号公告:0.6 mL浓盐酸加入100 mL水中，衍生化回收率的重复性不好，造成标准曲线的线性不太好，结果如图2～图4所示。

图1 AOZ定量离子标准曲线y=0.05530 x(r=0.96985)Fig 1 AOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.05530 x(r=0.96985)

图2 AHD定量离子标准曲线y=0.04788 x (r=0.98370)Fig 2 AHD Quantitative Ion Standard Curvey=0.04788 x (r=0.98370)

图3 SEM定量离子标准曲线y=0.05071 x (r=0.97434)Fig 3 SEM Quantitative Ion Standard Curvey=0.05071 x (r=0.97434)

图4 AMOZ定量离子标准曲线y=0.05995 x (r=0.16883)Fig 4 AMOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.05995 x (r=0.16883)

方法改进后，1.6 mL浓盐酸加入100 mL水中衍生化回收率的重复性明显改善，得到的标准曲线线性很好，结果如图5～图8所示。

图6 AHD定量离子标准曲线y=0.17715 x (r=0.99977)Fig 6 AHD Quantitative Ion Standard Curvey=0.17715 x (r=0.99977)

图7 SEM定量离子标准曲线y=0.28517 x (r=0.99989)Fig 7 SEM Quantitative Ion Standard Curvey=0.28517 x (r=0.99989)

图8 AMOZ定量离子标准曲线y=0.18027 x (r=0.99995)Fig 8 AMOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.18027 x (r=0.99995)

2.2 提取过程 磷酸氢二钾溶液，783号公告为87.1g磷酸氢二钾溶于500 mL水中。通常所用的磷酸氢二钾为三水化合物，折完水应为114.11 g[14]。

2.3 离心过程 783号公告显示离心转速为4000 r/min，实验发现此转速离心后，上层液较浑浊，将转速提升至10000 r/min时，可以很好的分层，上清液较澄明(图9、图10)。

图9 离心转速为4000 r/min上层液体Fig 9 Centrifugal speed 4000 r/min upper liquid

图10 离心转速为10000 r/min上层液体Fig 10 Centrifugal speed 4000 r/min upper liquid

2.4 定容过程 氮气吹干乙酸乙酯后，783号公告使用甲醇溶液溶解，涡旋振荡残留物，实验发现由于油脂的存在，涡旋振荡残留物会发生严重的乳化现象。氮气吹干后加入1 mL正己烷除酯[15]，再加入甲醇溶液，涡旋10000 r/min离心10 min，离心后发现正己烷与甲醇溶液仍然发生乳化现象。氮气吹干乙酸乙酯后[16]，使用甲醇溶液溶解将涡旋速度限定在500 r/min以下，15 s,短时间缓慢涡动,不仅能很好的溶解残留物，同时避免油脂乳化。经检测并不影响回收率。

2.5 检测方法改进后回收率情况 由于783号公告所得标准曲线上的点分布较乱，改进后的方法标准曲线线性较好，可作为回收率计算的基础。通过如上衍生化过程、提取过程、离心过程、定容过程的改进，平行样品的阳性添加浓度为2.5 ng/g，称取2 g，上仪器浓度应为5 ng/mL。4种硝基呋喃代谢物的回收率在95%以上，标准偏差小于10%，回收率有明显的提升(图11～图15)。

图11 空白样品图谱Fig 11 Map of blank samples

图12 AOZ阳性添加样品图谱Fig 12 Map of AOZ positive samples added

图13 AHD阳性添加样品图谱Fig 13 Map of AHD positive samples added

图14 SEM阳性添加样品图谱Fig 14 Map of SEM positive samples added

图15 AMOZ阳性添加样品图谱Fig 15 Map of AMOZ positive samples added

2.6 检测的灵敏度 国家标准783-1-2006号公告中检测限为0.25 ng/g，使用改进后的方法，最低检出限可以达到0.1 ng/g。在空白的鲤鱼样品中加入适量标准溶液使之含有0.1 ng/g的4种硝基呋喃代谢物，称取2 g，上仪器浓度应为0.2 ng/mL。按照改进后的前处理方法进行前处理，可以得到信噪比大于3，回收率在80%～120%之间，标准偏差小于10%的检测结果(图16～图20)。

图16 空白样品图谱Fig 16 Map of blank samples

图17 0.1 ng/g AOZ添加样品图谱Fig 17 0.1 ng/g AOZ Add sample map

图18 0.1 ng/g AHD添加样品图谱Fig 18 0.1 ng/g AHD Add sample map

图19 0.1 ng/g SEM添加样品图谱Fig 19 0.1 ng/g SEM Add sample map

图20 0.1 ng/g AMOZ添加样品图谱Fig 20 0.1 ng/g AMOZ Add sample map

3 讨论与结论

农业部783-1-2006号公告，实现了水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的检测工作从无方法、无标准到有国家检测方法的革新，并且能够指导基层工作者进行这项检测工作。虽然本方法有很好的实用性，但在工作中也发现本方法存在回收率不高、重复性不好、基质效应较大等缺点。因此，在实际工作中通过不断对本方法进行研究与摸索，进一步对本方法进行了优化和改进，通过对以上论述整理与总结，本研究总共从以下几个方面对农业部783-1-2006号公告进行了优化：(1)进一步优化了水解衍生化酸性条件，加大了酸的浓度，提升了衍生化效率，提高了回收率，标准曲线线性得到明显改善；(2)根据提取过程实际市售磷酸氢二钾为三水化合物的情况，改进磷酸氢二钾的使用量，使得磷酸氢二钾的用量更加准确；(3)离心过程提升离心速度，使得上层液体更加澄清，分离效果更好；(4)本方法定容过程中限制甲醇溶液涡旋溶解速度，减轻乳化现象，使得前处理过程的净化效果更好，降低了仪器的基质效应。有的方法是进一步用正己烷除脂，然后高速离心，但是这样做也会造成乳化现象，导致分层不明显，进而导致回收率降低，因此，两相比较，本方法的净化效果和回收率更好；(5)做2.5 ng/g阳性添加后，回收率可以达到95%以上，提高了方法的回收率；(6)检测的灵敏度可达0.1 ng/g。将改进方法用于实际样品和标准样品的测定，提升了方法的准确度、精密度和灵敏度。综上所述，通过对国家标准783-1-2006号公告的进一步优化，大大提高了方法的实际应用效果，对于更好的做好硝基呋喃类药物及其代谢物的残留检测工作具有很好的现实意义。