高效液相色谱法测定七清败毒颗粒中黄芩苷含量的方法研究

侯丽丽，刘春龙，王 成，米彦飞，马晋东，刘 星

(1.山西省饲料兽药监察所，太原 030027；2.山西鑫华泽药业有限公司，晋中 030900)

七清败毒颗粒收载于《中国兽药典》2015版二部，具有清热解毒，燥湿止泻功能，主治湿热泄泻，雏鸡白痢[1]，处方中黄芩为君药。黄芩为唇形科植物黄芩 (ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥的根，属于传统中药[2-3]。春、秋二季采挖，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。黄芩苷为黄酮类化合物，无臭，味苦，是中药黄芩的主要有效成分[4-6]。七清败毒颗粒标准中无黄芩苷的含量测定项，为了更好控制产品质量，试验对七清败毒颗粒中黄芩苷的含量测定方法进行了研究。

1 仪器与材料

Agilent1200高效液相色谱系统，原装色谱工作站，四元梯度泵/G1311A，自动进样器/G1329A，柱温箱/G1316A，紫外检测器/G1314B，购于安捷伦科技有限公司。甲醇为色谱级，磷酸为优级，水为超纯水。黄芩苷对照品(批号Z0271705，含量96.8%)购自中国兽医药品监察所。七清败毒颗粒(批号20180415)100g/袋，山西双鹰动物药业有限公司提供。3家自制样，12家市售样共15个批次样品。不加黄芩的阴性样(批号20180415)100g/袋，山西双鹰动物药业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱条件 根据参考文献方法[1,7-11]和实验结果，采用色谱柱Thermo scientific BDS C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)，检测波长为280 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 系统适用性试验 取供试品溶液10 μL注入色谱仪，记录色谱图，结果表明：黄芩苷与相邻峰达到基线分离，分离度达到1.75，黄芩苷峰保留时间为16.0 min，理论板数为7923，峰面积为1399.80，峰高为51.24。试验证实，该方法系统适用性良好，见图1。

图1 系统适应性实验图Fig 1 Experimental diagram of system adaptability

2.3 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品30 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得600 μg/mL的黄芩苷对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液，加甲醇稀释成30 μg/mL黄芩苷对照品溶液，即得。

2.4 供试品溶液的制备 取本品研细的粉末1.0 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 阴性样品溶液的制备 用不含黄芩的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备得到阴性样品溶液。

2.6 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，供试品色谱中在与对照品色谱峰相应的位置出相同峰，阴性样品无吸收峰、无干扰，说明处方中其它成分不影响黄芩苷的含量测定，结果见图2～图4。

图2 黄芩苷对照品HPLC色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of baicalin reference

图3 七清败毒颗粒样品HPLC色谱图Fig 3 HPLC chromatogram of qiqing xiedu granules

图4 黄芩阴性样品HPLC色谱图Fig 4 HPLC chromatogram of scutellaria negative sample

2.7 方法学考察

2.7.1 线性关系试验 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含黄芩苷600 μg的溶液，即得对照品储备液。分别取储备液适量制成5、15、30、45、60、120 μg/mL黄芩苷对照品溶液，滤过，取续滤液，分别按上述色谱条件进样10 μL，测定峰面积。结果见表1。

表1 线性试验数据表Tab 1 Linear test data sheet

以峰面积为纵坐标，黄芩苷含量(X-mg/mL)为横坐标作线性回归，回归方程为：y=33.822 x + 28.9555，r = 0.9991，结果表明，黄芩苷在0.005～0.12 mg/mL(0.05～0.12 μg)范围内，峰面积与黄芩苷含量呈良好的线性关系。

图5 黄芩苷线性关系图Fig 5 Linear diagram of baicalin

2.7.2 精密度试验 取线性试验项下的同一份对照品(30 μg/mL)溶液，连续进样6次，每次进样10 μL，测定峰面积，精密度试验相对标准偏差RSD为0.92%，结果表明仪器有良好的精密度。结果见表2。

表2 精密度试验数据表Tab 2 Precision test data sheet

2.7.3 重复性试验 对同一批供试品样品QK-002(批号20180415)，配制6份供试品溶液，各取10 μL注入色谱仪，6份样品相对标准偏差RSD为 0.93%，结果表明重复性良好。结果见表3。

表3 重复性试验数据表Tab 3 Repeatability test data sheet

2.7.4 溶液稳定性试验 取同一供试品QK-002(批号20180415)溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样10 μL，记录色谱图和黄芩苷峰面积，供试品12 h内峰面积相对标准偏差RSD为0.82%，结果表明，样品溶液在12 h内稳定。

试验结果见表4。

表4 溶液稳定性试验数据表Tab 4 Solution stability test data sheet

2.7.5 加样回收率试验 对照品溶液制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含黄芩苷600 μg的溶液，即得对照品溶液。

加样回收样品溶液制备：精密称取同一批七清败毒颗粒阴性样品(批号20180415)1 g，置100 mL量瓶，分别加入上述对照品溶液2.5、2.5、5、5、7.5、7.5 mL，加甲醇适量，超声30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

照上述供试品方法制备6份供试品溶液，取10 μL注入色谱仪，记录色谱图，计算加样回收率。

回收率=(加对照品后测得的含量-加对照品前的含量)/实际所加对照品量×100%。结果见表5～表7。

表5 加样回收率试验结果1Tab 5 Recovery test results 1

表6 加样回收率试验结果2Tab 6 Recovery test results 2

表7 加样回收率试验结果3Tab 7 Recovery test results 3

结果表明，3次试验相对标准偏差RSD分别为1.51%、0.74%、0.89%，回收率试验符合规定。

2.8 耐用性试验

2.8.1 改变流动相中磷酸比例 取同一批供试品，改变流动相溶液比例(甲醇-水-磷酸的比例分别为43∶57∶0.18、43∶57∶0.22)进行测定，结果见表8。

表8 不同流动相比例试验数据表Tab 8 Test data sheet of different mobile phase ratios

结果同一供试品改变流动相比例后，RSD为0.36%。

2.8.2 改变供试品超声时间 改变超声时间(10 min，50 min)进行测定，结果见表9。

表9 不同超声时间试验数据表Tab 9 Test data sheets of different ultrasonic time

同一供试品在改变超声时间的条件下，RSD为0.22%。

2.8.3 改变柱温 改变柱温(28℃、32℃)进行测定，结果见表10。

同一供试品在改变柱温的条件下，RSD为0.57%。

2.9.4 不同色谱柱 分别用Thermo scientific BDS HYPERSIL C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Syncroni AQC18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Agilent XDB C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)三种不同的色谱柱进行测定，结果见表11。

表10 不同柱温试验数据表Tab 10 Test data table of different column temperatures

表11 不同规格色谱柱试验数据表Tab 11 Table of chromatographic column test data of different specifications

同一供试品在更换不同色谱柱下进行测定，RSD为0.80%。结果表明该方法耐用性良好。

2.9 样品测定 按以上确定的高效液相色谱法测定了15批七清败毒颗粒中黄芩苷含量的方法，结果见表12。

表12 15批样品含量测定结果Tab 12 Content determination results of 15 batches of samples

3 讨论与结论

目前，用高效液相色谱法测定黄芩苷含量的制剂很多，所用的流动相有甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)280 nm黄芩药材[1]、(43∶57∶0.2)278 nm四黄止痢颗粒[2]、(50∶50∶0.3)276 nm，甲醇-水-冰醋酸(50∶50∶1)274 nm/276 nm双黄连可溶性粉/双黄连注射液[3]等。用《中国兽药典》中黄芩药材流动相为甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)[1]，检测波长280 nm，Agilent 150 mm色谱柱，6 min出峰；Agilent 250 mm色谱柱，流动相甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，11 min出峰，理论塔板数2500；Thermo scientific BDS C18 250 mm，流动相甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，9 min出峰，有前沿峰、拖尾，调整流动相为甲醇-水-磷酸(45∶55∶0.2)11 min出峰，理论板数7000，但发现对照主峰前有小峰，与主峰的分离度仅为1.32，再调整流动相为甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)，用Thermo scientific BDS C18 250 mm试验，主峰约15.797 min出峰，用分离度切线法统计，理论塔板数达7837，分离度1.66，峰宽0.4174，对称因子1.09，峰高79.65，峰起始点14.957，结束点16.938，保留时间15.797符合要求，设置进样时间45 min/针。再换Agilent 250 mm色谱柱，流动相为甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)出峰时间21 min，右边有一小峰，理论板数7000，分离度差别不明显。考虑样品杂峰较多，最终确定用Thermo scientific BDS C18 250 mm色谱柱，流动相为甲醇-水-磷酸(41∶59∶0.2)达到良好分离效果。

供试品溶液制备时比较了回流提取法与超声提取法的效果，结果二者无明显差异，超声提取法较为简单，故选用超声提取法。按超声提取法分别超声时间15、30、45 min，测定黄芩苷含量，结果表明15 min结果偏低，超声30 min与45 min无明显差异，故超声时间定为30 min。

用高效液相色谱法测定七清败毒颗粒中黄芩苷含量的方法，简便、准确度高、重复性好，为进一步控制七清败毒颗粒的质量提供了依据。