七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马血管紧张素Ⅱ-2受体及炎症的影响*

秦起， 李芮， 曾庆繁 ***

(1.贵州医科大学 麻醉学院， 贵州 贵阳 550004； 2.十堰市太和医院 麻醉科, 湖北 十堰 442000)

脑缺血再灌注损伤是脑组织在缺血一定时间的基础上恢复血流后损伤加重、甚至发生不可逆性损伤的现象，近年来对其损伤机制及药物保护的研究已取得进展[1-3]。七氟醚是临床常用的吸入麻醉药，研究表明七氟醚预处理可以明显减轻脑缺血再灌注损伤，但是具体机制尚不清楚[4-6]。文献报道脑内分布有血管紧张素Ⅱ-2受体(Angiotensin Ⅱ-2 Receptor，AT2R)，AT2R激活后可以通过改善血液灌注、抗炎、神经恢复及再生等过程来保护脑组织[7-8]。本研究拟探讨七氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用是否与激活脑AT2R及抗炎作用有关，报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

七氟醚(批号79111，美国艾伯维公司)，AT2R拮抗剂PD123319(美国MCE公司)，线栓(北京西浓科技有限公司)，TTC (美国Sigma公司)，AT2R抗体(美国abcam公司)，GAPDH单克隆抗体(美国Proteintech公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(美国Proteintech公司)，TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒(上海欣博盛科技有限公司)，BCA蛋白测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。麻醉呼吸机及麻醉气体监测仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

1.2 动物分组与处理

8～10周龄、体质量260～280 g的健康雄性SD大鼠80只，由贵州医科大学实验动物中心提供[许可证号SCXK(黔)2018-001]，随机均分成假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注损伤组(IR组)、七氟醚+脑缺血再灌注损伤组(SP组)、AT2R拮抗剂+七氟醚+脑缺血再灌注损伤组(SPD组)及AT2R拮抗剂+脑缺血再灌注损伤组(PD组)。5组大鼠给予2.5%七氟醚和2 L/min的氧气吸入麻醉1 h、连续5 d，SPD组和PD组同时分别注射腹腔注射AT2R阻断剂1 mL (1 mg/kg)、5 d，其余3组大鼠腹腔注射等体积生理盐水；最后一天(第5天)麻醉和给药后24 h，IR组、SP组、SPD组及PD组大鼠制作脑缺血再灌注损伤模型，Sham组大鼠只分离颈总动脉不接扎。

1.3 七氟醚预处理

将需要麻醉的SP组、SPD组大鼠置于透明的密闭塑料麻醉箱(50 cm×30 cm×30 cm)，箱底铺一层钠石灰,将取暖器置于箱旁60 cm，维持鼠肛温36～37 ℃。进气口吸入2.5 %的七氟醚和2 L/min的氧气1 h/d、连续5 d。出气口接麻醉气体监测仪和废气回收罐,检测七氟醚、CO2及O2浓度,其它组在相应时间只吸入2 L/min的氧气,直至麻醉结束。麻醉过程中保持自主呼吸,密切观察监护仪及鼠皮肤颜色和呼吸幅度，麻醉结束后待大鼠自然清醒后放回鼠笼中。

1.4 脑缺血再灌注损伤模型制备

参照Longa等[9-10]改良的使用线栓阻塞大脑中动脉的方法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型。10%的水合氯醛 (350 mg/kg) 腹腔注射麻醉后将大鼠仰卧固定、消毒，右侧颈部旁正中纵行切口，依次分离出颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，缝线结扎颈外动脉和颈总动脉，动脉夹临时夹闭颈内动脉的远心端后，离颈外动脉与颈内动脉分叉处5 mm处作一切口，从切口处向颈内动脉插入线栓，轻微的突破感为止(18 mm左右)，线栓固定后缝合伤口，实施大脑中动脉阻塞导致脑缺血，2 h后稍微向外拔出线栓实施再灌注。

1.5 观察指标

1.5.1神经功能缺损评分(NDS评分) 参照Longa神经评分法，在局灶性脑缺血-再灌注24 h后，对实验大鼠进行神经行为学测试评分。NDS评分标准如下：无神经功能缺损计0分，轻度神经功能缺损(不能完全伸展对侧前肢)计1分,中度神经功能缺损(向对侧转圈)计2分,重度神经功能缺损(向对侧倾倒)计3分，不能自发行走，意识水平降低计4分。

1.5.2脑梗死体积测定 大鼠再灌注24 h后，各组随机选取5只。水合氯醛麻醉后迅速处死断头冰上取脑,置于-20 ℃冰箱20 min后切除额极与枕极,沿冠状面均匀切5片，置于2%的TTC染色液中，37 ℃温箱避光孵育30 min，中间每隔5 min轻轻翻动脑片，使其均匀着色，4%多聚甲醛4 ℃冰箱固定24 h。数码相机拍照照片输入Image-ProPlus6.0图像分析软件测梗死体积，各脑片梗死体积之和乘以厚度(2 mm)即为梗死体积，以梗死体积占全脑体积百分比反映脑梗死体积。

1.5.3AT2R蛋白含量测定 再灌注24 h后，水合氯醛麻醉后迅速断头处死冰上剥离海马组织,从海马组织中提取蛋白质，BCA法测蛋白浓度后，用PBS调整蛋白样品浓度与上样缓冲液等体积混合，100 ℃煮沸10 min，冷却后用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质进行分离，并将分离后的蛋白质转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。加入AT2R(1 ∶2 000)和 GAPDH (1 ∶5 000)抗体,4 ℃孵育过夜。TBST清洗膜后加入二抗(1 ∶5 000)进行孵育。ECL显色后图片输入Image-ProPlus6.0图像分析软件。采用AT2R与内参GAPDH的灰度值的比值来反映AT2R含量。

1.5.4海马组织炎症因子TNF-α、IL-1β的含量测定 从-80 ℃冰箱取出新鲜海马组织标本，剪碎后加适量PBS(100 mg蛋白加PBS 1 mL)，超声破碎仪破碎组织后制成匀浆，12 000 r/min离心10 min后取上清，BCA方法测定蛋白浓度。用ELISA试剂盒测定大鼠海马TNF-α和IL-1β含量,严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪测定标准品和样品的吸光度值。根据标准品的浓度和吸光度值绘制标准曲线，计算样品中TNF-α、IL-1β的浓度，根据稀释倍数和组织的总蛋白浓度计算海马TNF-α、IL-1β的含量。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 NDS评分

与Sham组比较,IR组、SP组、SPD组及PD组NDS评分明显升高，SP组NDS评分明显低于IR组，SPD组NDS分明显高于SP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠NDS评分(n=16)Tab.1 NDS score of rats in 5 groups

注：(1)与Sham组比较，P<0.05；(2)与IR组比较，P<0.05；(3)与SP组比较，P<0.05。

2.2 脑梗死体积

与Sham组比较，IR组、SP组、SPD组及PD组脑梗死体积明显升高，SP组脑梗死体积明显低于IR组，SPD组脑梗死体积明显高于SP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为TTC染色，B为脑梗死体积比较的直条图；(1)与Sham组比较，P<0.05；(2)与IR组比较，P<0.05；(3)与SP组比较，P<0.05。图1 5组大鼠缺血再灌注24 h后脑梗死面积Fig.1 Cerebral infarction area after 24 hours of ischemia-reperfusion in 5 groups of rats

2.3 AT2R蛋白含量

与Sham组比较，IR组、SP组、SPD组及PD组AT2R蛋白含量明显上调，SP组AT2R蛋白含量明显高于IR组，SPD组AT2R蛋白含量明显低于SP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：(1)与Sham组比较，P<0.05；(2)与IR组比较，P<0.05；(3)与SP组比较，P<0.05。图2 5组大鼠脑缺血侧海马AT2R相对表达量Fig.2 Relative expression of AT2R in hippocampus of rats with cerebral ischemia in 5 groups

2.4 TNF-a、IL-1β含量

与Sham组比较,IR组、SP组、SPD组及PD组海马TNF-a、IL-1β含量明显上调；与IR组比较，SP组海马TNF-a、IL-1β含量明显降低；与SP组比较，SPD组海马TNF-a、IL-1β含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠TNF-a、IL-1β含量Tab.2 TNF-a, IL-1 β content in 5 groups of rats

注：(1)与Sham组比较，P<0.05；(2)与IR组比较,P<0.05；(3)与SP组比较，P<0.05。

3 讨论

AT2R是一个由363个氨基酸编码组成的7次跨膜蛋白，研究表明脑内AT2R受体激活可以通过激活BDNF、PPAR-γ等多通路，促进脑部神经细胞分化、神经轴突生长、减轻氧化应激反应、神经炎症、增加脑血流量，抗细胞凋亡作用，是神经系统内源性保护通路之一[11]。在未成熟的大脑，AT2R表达丰富且分布广泛，主要集中在与运动、感觉、学习相关的中枢区域及边缘系统的某些结构如海马等，在成年大鼠中，这些部位的AT2R显著减少维持较低水平，但在脑缺血性损伤后AT2R表达量上调[12]。文献报道在大脑中动脉阻塞后，AT2R基因敲除大鼠缺血性脑损伤较野生型(Agtr2 +)更严重[13]。进一步研究发现，在脑缺血再灌注损伤24 h后AT2R才缓慢升高，7 d后达到高峰；给予AT2R激动剂激活AT2R后，大鼠脑梗死面积减小，神经行为障碍明显得到改善[7]。在本试验中，缺血再灌注24 h后，与Sham组比较,各组AT2R表达量增加，这与上述成年大鼠AT2R显著减少维持较低水平，脑缺血性损伤后AT2R表达量缓慢上调的研究结论一致；而经过七氟醚预处理后的SP组AT2R蛋白表达量明显增加，使用了AT2R拮抗剂的SPD组AT2R蛋白表达量明显下降，说明在缺血-再灌注损伤中，七氟醚预处理提前激活了脑血管紧张素AT2R的表达。推测PD组可能是由于成年大鼠AT2R蛋白维持较低水平以及在缺血-再灌注损伤前腹腔注射1mg/kg的AT2R拮抗剂PD123319剂量偏少的缘故，AT2R蛋白表达量与IR组、SPD相比无明显差异。

本研究采用线栓栓塞大脑中动脉制作大鼠脑局灶性脑缺血-再灌注模型，采用缺血2 h，再灌注24 h来模拟临床上常见的大脑缺血再灌注损伤，通过神经功能缺陷评分和脑梗死体积百分比两方面来来判断各组脑缺血再灌注损伤的结果。试验结果显示，与Sham组比较，IR组神经功能评分与脑梗死体积明显升高，说明缺血再灌注损伤模型建立成功。文献报道每天吸入2.5%七氟醚1 h、连续5 d，可明显减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，产生脑保护作用[14]。本试验也采用该方案，研究显示SP组的脑梗死百分比、神经功能缺陷评分比IR组明显降低。说明本试验中采用的七氟醚预处理方案对缺血再灌注损伤起到保护作用。

一些研究证实免疫、炎症反应与缺血性损伤有关，在缺血再灌注损伤后脑组织和血浆中TNF-α、IL-1β等细胞因子发生改变[15-17]。在本实验中除Sham组外，各组大鼠脑缺血再灌注24 h后海马TNF-α、IL-1β明显升高，说明炎症反应在脑缺血再灌注损伤中确实起着重要作用；与SP组相比，IR组、SPD及PD组TNF-α、IL-1β增加，脑损伤加重，这也说明了七氟醚预处理通过减轻脑缺血再灌注损伤的炎症反应，产生了保护作用[18]。文献报道在大脑中动脉阻塞后，给入AT2R激动剂C21，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β等表达明显降低[19]。在本实验中，与使用了AT2R阻断剂的SPD组相比，七氟醚预处理后的SP组AT2R明显增加，炎症因子TNF-α、IL-1β却降低，说明七氟醚预处理激活了AT2R蛋白，降低了脑的炎症反应。

综上所述，七氟醚预处理减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与提前上调脑血管紧张素AT2R，进而抑制缺血后的急性炎性反应有关。在本实验中并没有对七氟醚是通过什么通路激活脑血管紧张素AT2R进行研究，AT2R确切的激活机制尚有待于进一步研究[20-21]。七氟醚具有血气分配系数(0.63)低，刺激性小，吸收、清除快和麻醉维持可控等优点，且在脏器保护方面有潜在价值，通过对其保护机制的进一步研究,可以更好地指导围术期脏器缺血保护及临床治疗。