N-myc下游调节基因4表达与小细胞肺癌化疗多药耐药的关系

王瑜 黄峰 郭琳琅

南方医科大学珠江医院病理科（广州510280）

肺癌是世界最常见的癌症和导致癌症相关死亡的最主要原因［1］。据我国肿瘤登记中心2016年发布的数据显示，肺癌在我国男性肿瘤发病患者中占据榜首［2］。肺癌按照病理类型分类，主要包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌，小细胞肺癌占新发肺癌的10%～15%［3］。目前对小细胞肺癌的临床治疗以化疗为主，尽管患者对化疗药物反应较敏感，但由于极易出现多药耐药，化疗效果常不理想，临床预后较差。因此，阐明小细胞肺癌化疗耐药的分子机制，提高小细胞肺癌的生存率，是当今肺癌临床治疗的重要研究课题之一。N-myc下游调控基因（N-myc downstream regulated gene，NDRG）家族由4个成员组成，在细胞增殖和分化等过程中发挥作用。虽然对NDRG1和NDRG2进行了广泛的研究，但关于NDRG3和NDRG4的认识却很少［4］。NDRG4作为一种新的候选肿瘤抑制因子，与肿瘤的分化、侵袭、转移和分期有显著相关［5］。目前尚未见NDRG4与小细胞肺癌化疗耐药的相关报道。本研究采用免疫组化SP法检测NDRG4在小细胞肺癌组织及其正常肺组织中的表达情况，探讨NDRG4与小细胞癌化疗耐药及临床预后的关系。

1 资料与方法

1.1样本收集小细胞肺癌组织收集于2013年1月至2017年10月期间南方医科大学珠江医院、中山大学孙逸仙纪念医院的手术及穿刺活检标本共48例，所有病例的病理诊断均经两位以上病理专家确诊；另取48例正常肺组织作为对照。

1.2小细胞肺癌患者临床病理特征男45例，女3例；60岁以下岁患者20例，60岁以上患者28例，中位发病年龄60岁；局限期（LD）患者28例，广泛期（ED）患者20例；截止本研究结束仍存活患者12例，死亡患者36例。

1.3试剂浓缩型兔抗人NDRG4多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），通用型试剂盒（SP-9000），浓缩型DAB试剂盒、多聚赖氨酸、柠檬酸组织抗原修复液粉剂、PBS粉剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.4免疫组化步骤将石蜡切片置入100%二甲苯脱蜡2次，每次10 min。依次经100%、95%、85%、75%乙醇和纯水各1次，每次5 min；PBS洗3次，每次5 min；脱蜡后玻片放入盛有0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH=6.0）微波进行抗原修复15 min；冷却至室温。PBS洗3次，每次5 min；然后玻片用7%BSA（BPS∶BSA=100∶7）37 ℃下封闭30 min；滴加一抗（1∶200）4℃过夜孵育；室温平衡30 min，PBS洗3次，每次5 min；玻片滴加生物素标记的羊抗鼠二抗（1∶2 000），37℃湿盒30 min；用PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB显色5～10 min；PBS清洗DAB溶液，1次，每次5 min；苏木素复染1 min，1%酒精盐酸分化，自来水返蓝；75%、85%、95%、100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，每次3 min。待玻片干燥后，用中性树脂封片；结果判定：NDRG4阳性染色为细胞浆呈棕黄色。

1.5免疫组化阳性判断标准NDRG4阳性表达主要定位在细胞浆。按照半定量积分方法，随机观察10个高倍视野（×200倍），判断结果：综合切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和着色强度评分，NDRG4阳性百分比评分：0%（0分），1% ～10%（1分），＞10%（2分）；染色强度评分：不着色（0分），弱着色（1分），中等强度以上着色（2分）。阳性细胞百分比与着色强度评分相加，总分0～2分为NDRG4表达缺失或低表达判为NDRG4表达阴性，3～4分判为NDRG4表达阳性。由2位病理医师双盲法读片并计数。

1.6统计学方法所有结果均经SPSS 20.0统计软件进行分析，NDRG4表达与临床病理特征分析采用列联表资料分析；多因素对小细胞肺癌患者生存时间的影响采用逐步Cox回归模型分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NDRG4在小细胞肺癌组织中的表达及正常肺组织中的表达情况NDRG4阳性表达位于细胞浆（图1）。NDRG4蛋白在48例小细胞肺癌组中，10例表达阳性，38例表达阴性，NDRG4在小细胞肺癌组织中阳性表达率为20.83%（10/48）；NDRG4蛋白在48例正常肺组织中，45例表达阳性，3例表达阴性，NDRG4在正常肺组织中阳性表达率为93.75%（45/48）。NDRG4在小细胞肺癌组织中表达显著低于正常肺组织，差异具有统计学意义（χ2=52.151，P＜0.001）。

图1 NDRG4的免疫组化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of NDRG4

表1 NDRG4表达与小细胞肺癌临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between NDRG4 expression and clinical pathological features of SCLC 例

2.2NDRG4在小细胞肺癌组织中的表达情况其与临床病理特征的关系NDRG4的表达与患者的性别无相关性（χ2=0.303，P=0.582）；NDRG4的表达与患者的年龄无相关性（χ2=0.317，P=0.573）；NDRG4的表达与患者的临床分期无相关性（χ2=0.707，P=0.400）。见表1。NDRG4的表达与患者的Ki-67增殖指数有相关性（χ2=4.076，P=0.044），NDRG4阳性患者Ki-67增殖指数低于NDRG4阴性患者，提示NDRG4阳性的肿瘤增殖指数更低。

2.3NDRG4在小细胞肺癌组织中的表达情况与化疗耐药以及生存期的关系48例小细胞肺癌患者中对化疗敏感的23例，出现耐药的25例，化疗敏感的患者中NDRG4阳性表达率为34.78%（8/23），化疗多药耐药的患者中NDRG4阳性表达率为8.00%（2/25），化疗敏感的NDRG4阳性表达率患者显著高于化疗多药耐药的患者（χ2=5.210，P=0.033）。NDRG4的表达与患者的生存期有显著的相关性，生存的12例患者中，NDRG4阳性者7例；死亡的36例患者中，NDRG4阳性者3例，NDRG4阳性的患者生存显著高于NDRG4阴性的患者，差异具有统计学意义（χ2=13.642，P=0.001）。

2.4小细胞肺癌患者生存分析采用逐步COX回归模型分析NDRG4阳性表达与患者的生存时间的关系，变量的赋值情况见表2。其中变量“性别”的相对危险度为7.260，即女性患者的死亡风险是男性患者的7.260倍（P=0.015），变量“NDRG4”的相对危险度为7.590，即NDRG4阴性表达的患者死亡风险为NDRG4阳性表达患者的7.590倍（P=0.009），NDRG4的表达与患者生存曲线图见图2。变量“疗效”的相对危险度为2.244，即化疗耐药患者死亡风险为化疗敏感患者的2.244倍（P=0.035）（表3）。综上所述，患者的性别、化疗疗效以及NDRG4的阳性表达均与患者的生存时间相关。

表2 变量的赋值Tab.2 Valuation of variables

图2 NDRG4的表达情况与患者生存曲线图Fig.2 NDRG4 expression and patient survival curve

表3 逐步COX回归模型分析结果Tab.3 Analysis of stepwise COX regression model

3 讨论

小细胞肺癌肿瘤细胞倍增时间短，进展快，极易出现继发性耐药。化疗耐药性的形成伴随着细胞成分和生物过程的变化，如代谢重塑，胆固醇代谢可能有助于化疗耐药性［6］。此外，H3K9组蛋白甲基化可能在抑制肿瘤抑制基因和促凋亡基因的表达以促进耐药性中起到重要作用。在富含细胞成分的途径中，TRIPATHI等［7］发现突触小泡也可能在耐药性中起重要作用，包括ABCC1相关多药耐药性中起关键作用的ATP合酶复合物。超级增强子在获得化疗耐药性等方面发挥着重要作用［8］。超级增强子作为跟踪癌症演变的生物标志物，最终可能成为干预治疗的重要目标［9］。

靶向治疗与免疫治疗是近年来肺癌研究领域的焦点［10］。近年针对非小细胞肺癌靶点的靶向药物治疗获益，目前还没有分子靶向药物被批准为小细胞肺癌患者的常规治疗［11］。其中可用于小细胞肺癌化疗耐药的二线治疗的单克隆抗体有nivolumab和pembrolizumab，nivolumab联合ipilimumab与nivolumab单药方案治疗含铂两药联合化疗进展的晚期小细胞肺癌［12］。免疫疗法PD-1/PDL-1抑制剂可针对化疗耐药的小细胞肺癌患者发挥持续疗效，部分患者可长期生存获益［13］。

NDRG家族作为与细胞增殖和分化密切相关的新基因，其在肿瘤发生、发展、转归中的作用越来越受到关注。在中国胃癌患者中，NDRG4启动子甲基化可以作为胃癌的诊断生物标记物，并可以作为不良的临床预后的预测指标［4］。另有学者［14］报道NDRG4在宫颈癌细胞中可能作为抑癌基因发挥作用，为宫颈癌的治疗提供了潜在的分子靶标。胃癌中NDRG4蛋白的表达与肿瘤的分化、侵袭、转移和分期有显著相关性，NDRG4可能是一种潜在的胃癌抑制和预后标志物［15］。

本研究通过免疫组化方法检测NDRG4在小细胞肺癌组织及正常肺组织中的表达，分析其临床意义。研究结果表明，与正常肺组织相比，NDRG4中在小细胞肺癌组织中表达显著下调，表明NDRG4在小细胞肺癌组织中的表达被抑制，提示NDRG4基因在小细胞肺癌中也可能具有抑癌作用，作为小细胞肺癌的新型抑癌基因参与小细胞肺癌的发生发展。NDRG4表达阳性小细胞肺癌患者的生存期明显延长，NDRG4表达阴性的小细胞肺癌患者生存期明显缩短，提示NDRG4与患者的临床预后有关。NDRG4表达缺失的患者对一线化疗不敏感，容易出现继发性多药耐药，NDRG4表达阳性的患者对一线化疗较为敏感，提示NDRG4可能参与了小细胞肺癌化疗多药耐药的调控，NDRG4的表达水平对评估小细胞肺癌化疗药物的疗效具有指导意义。对小细胞肺癌患者进行COX回归生存分析，患者的性别、化疗疗效以及NDRG4的阳性表达均与患者的生存时间相关。

综上所述，NDRG4在小细胞肺癌中表达显著低于正常肺组织，NDRG4阴性的小细胞肺癌患者更容易出现多药耐药，导致较差的临床预后与较短的生存期，由此推测NDRG4的蛋白可以作为预测小细胞肺癌临床预后的生物标志物之一。

致谢：感谢中山大学孙逸仙纪念医院为本研究提供部分手术及穿刺活检标本。