实时荧光定量PCR法对肝衰竭合并侵袭性肺曲霉菌病患者的诊断价值

卓丽 兰芸 李粤平 陈万山 邓西龙

广州医科大学附属市八人民医院感染病中心（广州510060）

侵袭性肺曲霉菌病（invasive pulmonary asper- gillosis，IPA）不仅局限于急性白血病、骨髓干细胞移植、实体器官移植、恶性肿瘤化疗等传统的免疫低下患者，也常见于肝衰竭的患者［1］。肝衰竭患者感染IPA后临床症状常不典型，常加重肝衰竭的病情和明显增加病死率。早期诊断是成功治疗IPA的关键，肝衰竭合并IPA患者影像学方法极少见到“晕轮征、新月征”等曲霉感染的特异性表现［2］。另外，由于肝衰竭患者凝血功能低下，纤维支气管镜检查、肺穿刺或活检存在容易引起肺出血等危及生命的高风险并发症。因此，在临床上肝衰竭患者难以获得无菌标本培养及病理组织学标本以确诊IPA。根据文献［3-4］报道，实时荧光定量PCR法测定血清曲霉菌DNA含量的敏感性及特异性均较半乳甘露聚糖检测（GM试验）高，可以协助诊断IPA。本研究拟通过荧光实时定量PCR法检测肝衰竭合并IPA患者血清曲霉菌DNA含量，并与GM试验对比，探讨该方法在肝衰竭合并IPA诊断的价值。

1 对象与方法

1.1研究对象本研究纳入广州市第八人民医院2013年3月至2017年3月住院的肝衰竭患者30例，其中符合诊断肝衰竭合并IPA患者共17例；肝衰竭无肺部感染者13例，并纳入20例健康人作为空白对照。肝衰竭患者的诊断标准符合2018年中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组修订的肝衰竭诊疗指南中诊断标准［5］，IPA的诊断标准符合重症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南［6］。本研究的一般资料见表1，其中肝衰竭合并IPA与肝衰竭无肺部感染者一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。符合入选标准的患者留血清样本，-80℃冰箱保存备用，所有留取血清样本的患者均签署知情同意书。

1.2标准菌株及DNA标准品烟曲霉菌标准菌株由广州医科大学附属市八人民医院检验科细菌室提供，标准菌株接种于土豆培养基37℃培养3 d，挑取菌落制成曲霉菌属孢子悬液。血球计数板显微镜下计数，作为标准菌株存储液于-20℃冰箱中备用。使用QIAGEN公司真菌DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）提取真菌基因组，提取产物以紫外分光光度计测量A260/280，-80℃保存。菌株DNA通过测序获得核苷酸序列，经BLAST比对验证为曲霉菌DNA。

1.3引物及探针本研究使用既往文献报道的引物和探针［7］，其靶向5种曲霉菌（烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌）18s rRNA保守序列的基因，具体序列如下：上游引物5′-TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT-3′，下 游 引 物 5′-TCTAAGGGCATCACAGACCTG-3′，TaqMan探针：5′-FAM-TCGGCCCTTAAATAGCCCG2GTCCGC-TAMRA-3′。

1.4标准品制备以已提取的烟曲霉菌标准菌株的DNA作为模板，使用上下游引物进行扩增，PCR产物使用胶回收试剂盒进行回收，回收产物连接至质粒载体（pMD 19-T Vector，TaKaRa，大连），导入DH5α感受态细胞（TaKaRa，大连）进行目的片段的质粒克隆，并对菌液进行质粒提取，Nanodrop 2000核酸定量仪进行定量，根据浓度转换为拷贝数的公式进行转换，拷贝数浓度（拷贝/mL）=（质量/分子量）×6.02×1023。

1.5血清曲霉DNA提取使用200 μL血清进行核酸提取，使用QIAGEN公司真菌DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）提取真菌基因组，具体步骤按试剂盒操作进行，-80℃保存备用或立即进行实时荧光PCR检测。

1.6实时荧光PCR检测血清样本曲霉DNA实时荧光PCR反应管中依次加入上下游引物各2 μL，TaqMan探针1 μL、2×TaqMan universal PCR master mix（ABI公司，美国）12.5 μL，提取的DNA 模板5 μL，反应总体系为25 μL。反应程序为：50 ℃2 min，94 ℃ 10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共50个循环。PCR反应在ABI 7300平台进行。

1.7GM试验GM试验采用Platelia Aspergillus（Bio-Rad公司）试剂盒，根据说明书进行操作并判读结果，由我院检验科完成。

1.8统计学方法本研究计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用例数和百分比表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 30例肝衰竭患者及20例健康肝衰竭无肺部感染组的一般资料Tab.1 The clinical characteristics in 30 cases of liver failure patients and 20 cases of healthy control group

2 结果

2.1血清GM试验结果本研究纳入的30例肝衰竭的患者中，GM试验阳性者共12例，肝衰竭合并IPA组9例，阳性率为52.94%（9/17）；肝衰竭无肺部感染组3例，阳性率为23.08%（3/13）。GM试验阴性者共18例，肝衰竭合并IPA组8例，肝衰竭无肺部感染组10例。20例健康肝衰竭无肺部感染组的血清GM试验均为阴性。

2.2荧光定量PCR法血清标本曲霉菌DNA检测结果根据质粒的荧光PCR定量结果，本研究实时荧光定量的灵敏度为100 copies/mL，在实时荧光定量PCR法测定30份血清标本中，有16份可检测出曲霉菌DNA，最大值为7 988.73 copies/mL，最小值为281.11 copies/mL，中位数为938.79 copies/mL。可检测到曲霉菌DNA的样本均视为荧光定量PCR阳性，肝衰竭合并IPA组15例，肝衰合并IPA组为88.2%（15/17）；肝衰竭无肺部感染组12例，阳性率为7.7%（1/13）。曲霉DNA定量≥1 000 copies/mL定义为强阳性，肝衰合并IPA组为6例，强阳性率为35.29%（6/17），肝衰竭无肺部感染组无检测出强阳性的曲霉DNA。20例健康肝衰竭无肺部感染组血清曲霉DNA检测均为阴性。

2.3肝衰竭合并IPA组与肝衰竭无肺部感染组两种检测结果的比较

2.3.1肝衰竭合并IPA组血清曲霉菌DNA与GM试验结果的比较在肝衰竭合并IPA组17例的血清样本中，实时荧光定量PCR测定血清曲霉菌DNA阳性15例（88.2%），阴性2例（11.8%）；GM试验阳性9例（47.1%），阴性8例（52.9%）。两种方法阳性率差异有统计学意义（P=0.026），实时荧光定量PCR测定曲霉DNA阳性率明显高于GM试验。肝衰竭合并IPA组中，荧光定量PCR法测定血清曲霉菌DNA强阳性的患者共6例（35.3%），荧光定量PCR法测定血清曲霉菌DNA强阳性率与GM试验阳性率的差异无统计学意义（P=0.728）。见表2。

表2 肝衰竭合并IPA组两种试验方法阳性率的比较Tab.2 Comparison of the difference of positive rate between real-time PCR and GM test method in the liver failure patients with IPA 例（%）

2.3.2肝衰竭无肺部感染组血清曲霉菌DNA与GM试验结果的比较在肝衰竭无肺部感染组的13例血清样本中，荧光定量PCR测定血清曲霉菌DNA阳性1例（7.7%），阴性12例（92.3%）；GM试验阳性3例（23.1%），阴性10例（77.0%）。两种方法阳性率差异无统计学意义（P=0.592），见表3。

表3 肝衰竭无肺部感染组两种试验方法阳性率的比较Tab.3 Comparison of the difference of positive rate between real-time PCR and GM test method in the liver failure patients without pulmonary infection 例（%）

3 讨论

肝衰竭患者由于使用广谱抗生素或激素治疗，容易合并浅部或深部真菌感染，合并IPA的临床表现较为隐匿且预后差，死亡率高［8-10］。肝衰竭并发IPA的高死亡率不仅与基础疾病的严重性有关，还与未能及时明确诊断有关。意大利学者报道了他们经治的2例重症肝病并IPA以及总结的文献报道的72例重症肝病并发IPA的患者，病死率高达72.2%，仅35例患者接受了抗真菌治疗，其余患者均为死亡后才得以确诊［11］。国内的学者也对肝衰竭合并IPA进行研究，研究结果提示早期诊断是成功治疗的关键［12］。

肝衰竭的患者合并IPA临床表现常隐匿，早期的肺部CT的表现不典型，早期诊断较为困难，GM试验为临床常用的辅助诊断的指标，但由于其存在假阳性和假阴性，尤其是血清样本［13-15］，可能延迟初始抗真菌治疗的时间，影响临床的疗效。荧光定量PCR检测曲霉菌DNA较高的灵敏度和特异性，既往曾有国内外学者使用荧光定量PCR对IPA的诊断进行研究。德国学者应用荧光实时定量PCR方法检测曲霉菌DNA，认为其敏感性高，同时能准确定量、假阳性率低，有利于侵袭性曲霉菌的早期诊断［16］。以色列学者回顾性分析2005-2016年使用荧光实时定量PCR方法检测肺泡灌洗液曲霉菌DNA的结果，也认为使用荧光实时定量PCR方法检测曲霉菌DNA有高灵敏性和特异性的特点［17］。国内学者应用荧光定量PCR检测接受异基因造血干细胞移植患者56例的血清曲霉菌DNA进行研究，结果提示敏感度和特异度分别为94.4%和100.0%［2］。提示荧光定量PCR检测血清曲霉菌DNA有利于早期诊断IPA。但目前，荧光定量PCR检测在肝衰竭合并侵袭性肺曲霉菌病患者的诊断价值的报道较少。

本研究的结果表明，在17例诊断IPA患者中，16例荧光定量PCR检测血清曲霉菌DNA阳性，灵敏度优于GM试验；肝衰竭无肺部感染组的13例患者仅有1例患者的血清样本阳性，GM试验3例阳性，虽荧光定量PCR法与GM试验阳性率差异无统计学意义，但阳性率低于GM试验。综上所述，荧光定量PCR检测外周血曲霉DNA可协助肝衰竭合并侵袭性肺曲霉菌病的诊断，但IPA早期临床表现无特异性，本研究暂未纳入早期IPA患者的血清样本进行研究，因此，下一步的研究拟纳入肝衰竭并早期IPA患者的血清样本进行研究，探讨荧光定量PCR检测外周血曲霉DNA对肝衰竭合并IPA早期诊断的应用价值，另外，本研究的样本量较少，亦需要扩大样本量进行进一步验证。