CD55启动子区多态性与直肠癌发病风险的研究

付宁 仵红娇 谢俞宁 李昂 贾祯贤 张雪梅

华北理工大学生命科学学院（河北唐山 063210）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第3常见的癌症，发病率位于第3位且病死率仅次于肺癌［1］。尽管美国、澳大利亚、加拿大、新西兰和欧洲部分地区的CRC发病率较高，亚洲、非洲和南美人口面临的风险最低［2］，我国结直肠癌发病率占第3位并且病死率占第4位［3］。此外，生活方式和饮食习惯可能导致结直肠癌发生发展的重要原因［4］和也是研究热点［5-6］。CD55是膜结合型补体调节蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins，mCRPs），参与结直肠癌［7］、乳腺癌［8］、宫颈癌［9］和肝癌［10］等肿瘤细胞的逃逸过程。此外，CD55 rs2564978多态性与结直肠癌的发病风险关系尚未明确。本研究应用GEPIA分析CD55在结直肠癌中的表达情况；使用病例-对照研究方法，探讨CD55 rs2564978多态性对结直肠癌发病风险的影响。本研究旨在为结直肠癌病因研究和临床治疗提供潜在靶标。

1 资料与方法

1.1一般资料本研究于华北理工大学附属唐山市工人医院、华北理工大学附属唐山市人民医院收集自2008年4月起至2012年12月结直肠癌患者的外周血样本。其中结肠癌患者410例，直肠癌患者480例，所有癌症病例均经过病理学检验确诊。收集医院体检中心同一时期进行体检的健康人群外周血，对照组按年龄和性别分别与病例组进行成组设计，随机选取410例健康人外周血作为结肠癌对照组，随机选取480例健康人外周血作为直肠癌对照组。对照组均无既往肿瘤史且与病例组无血缘关系。以查阅病历资料和问卷调查方法收集研究对象一般人口学资料及临床病理资料，全部研究对象均签署知情同意书。本研究获得华北理工大学伦理委员会批准。

1.2研究方法外周血提取DNA，使用天根生化科技（北京）有限公司血液基因组DNA提取试剂盒（DP318），严格按照试剂盒说明书进行操作，提取产物置于-20℃冰箱储存。基因分型，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术。首先使用PCR技术扩增所需目的DNA片段，CD55 rs2564978上游引物序列：5′-ATGAACAATGTT CACTCCCTACTGTGGTA-3′和下游引物序列：5′-TAAGGAGGAAGGGCGTCATC-3′，由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行引物合成。PCR反应体系：1×Taq PCR starmix 6 μL、DNA 2 μL、上下游引物各0.1 μL、去离子水1.8 μL，总体积9 μL。PCR扩增反应：94 ℃预变性3 min；94℃变性40 s、61.5℃退火 30 s、72℃延伸25 s，30个循环；72℃延伸3 min。扩增产物使用限制性内切酶消化切割进行基因分型，酶切条件：加入限制性内切酶RsaI（New England Biolabs，Hitchin，UK）37℃孵育过夜，可得TT基因型为一个101 bp的片段，CC基因型为79 bp和22 bp的两个片段，CT基因型为101、79和22 bp三个片段，使用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。为保证本研究基因分型可靠性，随机挑选10%样本进行重复实验，重复结果与原结果一致。

1.3统计学方法采用SPSS 23.0软件进行数据分析。使用χ2检验比较分类变量（如：性别、年龄和吸烟状况）的分布及病例和对照组之间基因型的分布差异，使用非条件Logistic回归计算比值比（odds ratios，OR）及95%置信区间（confidence intervals，CI）。所有的统计检验均为双侧概率检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.4生物信息学分析对国际共享数据库Ensembl中CD55启动子区SNP信息进行数据挖掘，筛选出可能影响基因表达或基因功能的SNP位点。且所筛选SNP位点的次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）在中国人群中＞ 0.05，利用TRANSFAC软件对SNP位点进行预测，最终筛选出对转录因子结合有影响的SNP位点。

使用基因表达谱动态分析［11］（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在线数据库进行表达差异分析，基于TCGA和GTEx数据，分析CD55在结直肠癌中癌组织和癌旁组织表达差异。

2 结果

2.1CD55rs2564978筛选及其在结直肠癌组织中的表达利用生物信息学筛选出对CD55转录因子结合有影响的SNP为CD55 rs2564978。此外，本研究纳入TCGA和GTEx数据库结肠癌组织349例、癌旁对照275例；直肠癌组织318例、癌旁对照92例。通过GEPIA分析其表达差异，结果发现在结肠癌和直肠癌组织中CD55基因的表达均高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 CD55在结直肠癌癌组织和癌旁组织中的表达Fig.1 Expression of CD55 in colorectal cancer tissues and adjacent tissues

2.2研究对象人口特征情况本研究直肠癌病例男301例（62.7%），女179例（37.3%），其对照组男302例（62.9%），女178例（37.1%），平均年龄60岁。结肠癌男225例（54.9%），女185例（45.1%），其对照组男228例（55.6%），女182例（44.4%），平均年龄60岁。结果发现，病例组与对照组性别、年龄、吸烟和饮酒差异均无统计学意义（P＞0.05，表1），表示病例组与对照组间具有可比性。

表1 研究对象基本特征Tab.1 Basic characteristics of the research objects 例（%）

2.3CD55 rs2564978多态性与结肠癌和直肠癌发病风险关系结肠癌和直肠癌对照组中，基因型的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（HWE），说明该研究人群具有代表性。研究结果分析（表2）发现，直肠癌病例组CD55 rs2564978 TT基因型携带者135例（28.1%），CT基因型携带者247例（51.5%），CC基因型携带者98例（20.4%）；对照组CD55 rs2564978 TT基因型携带者163例（34.0%），CT基因型携带者237例（49.3%），CC基因型携带者80例（16.7%）。经非条件Logistic回归分析，与CD55 rs2564978 TT基因型携带者相比，CC基因型携带者直肠癌发病风险明显升高（OR=1.479，95%CI：1.015 ～ 2.154，P=0.042）。结肠癌病例组CD55 rs2564978 TT基因型携带者113例（27.5%），CT基因型携带者216例（52.6%），CC基因型携带者81例（19.7%）；对照组CD55 rs2564978 TT基因型携带者146例（35.6%），CT基因型携带者192例（46.8%），CC基因型携带者72例（17.6%）。经非条件Logistic回归分析，CD55 rs2564978多态性与结肠癌发病风险无关（P＞0.05）。

2.4CD55 rs2564978多态性与直肠癌发病风险关系分层分析进一步对性别、年龄、吸烟和饮酒进行分层分析（表3）。与CD55 rs2564978 TT基因型相比，CC基因型可增加高年龄组（＞60岁）直肠癌患病风险（OR=2.116，95%CI：1.210 ～ 3.701，P=0.009），不影响低年龄组（≤60岁）直肠癌患者的发病风险（OR=1.088，95%CI：0.638 ～ 1.856，P=0.756）。性别、饮酒和吸烟分层分析结果发现CD55 rs2564978多态性与直肠癌发病风险无关（P＞0.05）。

表2 CD55多态性与结直肠癌发病风险关系Tab.2 Relationship between genetic variation of CD55 and risk of colorectal cancer 例

3 讨论

衰变加速因子CD55是一种糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇固定在细胞膜上，具有4个短的一致重复结构域［12］。CD55参与了补体过度活化，从而在某些形式的蛋白质丢失性肠病中的发挥作用［13-14］。通过干扰经典和替代途径中的C3/C5转化酶抑制补体活化从而发挥补体抑制剂的作用［15］。CD55在恶性肿瘤组织中广泛表达，能够通过酪氨酸激酶途径及特异性与CD59结合促进肿瘤的发生。在以往研究中，CD55可减少补体介导的肿瘤细胞裂解，促进新血管形成、侵袭和转移［16］；CD55在血液系统肿瘤中高表达与慢性淋巴细胞白血病的治疗有关［17］；此外在食管癌研究中，携带CD55 rs2564978 CC基因型可增加食管癌的发病风险，与吸烟交互作用共同影响食管癌发病风险［18］；并且CD55 rs2564978多态性增加了中国人群非小细胞肺癌的发病风险［19］；而CD55 rs2564978多态性与胃癌易感性有显著的相关性［20］。

表3 CD55 rs2564978多态性与直肠癌发病风险关系分层分析Tab.3 Stratified analysis of the relationship between genetic variation of CD55 rs2564978 and the risk of rectal cancer 例

利用生物信息学筛选出对CD55转录因子结合有影响的SNP位点为CD55 rs2564978并且rs2564978位于CD55基因启动子区，其在肿瘤方向的相关研究甚少。通过GEPIA分析，本研究发现CD55在结直肠癌患者中高表达。既往研究报道［21-22］在其启动子区域内，单核苷酸多态性可能影响转录活性。笔者推测在结直肠癌发生发展中，CD55启动子区rs2564978多态性可能影响CD55转录因子活性进而CD55表达发生了某种改变。通过PCR-RFLP发现，CD55 rs2564978多态性增加了中国北方人群的发病风险。与CD55 rs2564978TT基因型携带者相比，携带CC基因型可增加高年龄组直肠癌发病风险。然而，CD55 rs2564978多态性和结肠癌发病风险无关（P＞0.05）。本研究结果与笔者前期在食管癌［15］和肺癌［16］中研究结果一致。该研究说明CD55在结直肠癌中高表达并且结直肠癌遗传易感性可能与CD55 rs2564978多态性有关，为结直肠癌的诊断提供了一个新的方向，探索结直肠癌诊断潜在分子标志物和治疗靶点提供理论依据。

由于本研究选取研究对象均来自同一地区，并不能代表全国结直肠癌患者的情况，因此对这些结果加以解释需要更加谨慎，还需其他地区人群作为研究对象增加实验结果的可靠性。本研究仅对性别、年龄、饮酒及吸烟状况进行了分析，结果具有一定局限性。