榆芩颗粒提取工艺的优选研究

向梅先，黄玉莹，甘大莉，范亚

(中南民族大学 药学院，武汉430074)

炎症是常见多发性病症，是活体组织对炎性因子产生的以预防为主的反应，临床表现为红、肿、热、痛及功能障碍，并伴有发热、白细胞增加、单核-吞噬细胞系统增生等全身反应，是由炎症介质分子和/或细胞因子介导的一个过程[1].研究表明炎症与中风、偏头疼、癌症、骨关节炎、哮喘、老年性痴呆、动脉硬化、心脏病、牙周炎、慢性疲劳综合征等有关[2-4].

中药对感染性疾病、炎症等具有较好疗效，中药复方配伍可产生协同作用，还能增强患者免疫力；且中药具有毒副作用小，不易产生耐药性，可持续服用等优势[5].目前市面上疗效较好的中药抗炎药主要有：蒲地蓝消炎片、消炎片(蒲公英、紫花地丁、野菊花、黄芩)、双黄消炎片、炎立消胶囊、穿王消炎胶囊等，但这些药虽具备较好的抗炎作用，却普遍不同时具有抗菌、消炎等作用.

中药复方颗粒[6]是以符合炮制规则的标准饮片为原料，经过提取、浓缩、干燥、制粒等步骤制备成的产品[7]，既保持了中药复方多靶点，多活性，也保持了颗粒剂的基本优点，比如可分散或溶解在水或其他适宜的液体中服用.纯中药制剂榆芩颗粒是三甲医院制剂，临床使用多年，具有较好的抗菌和消炎作用，主要用于痢疾，上呼吸道感染，扁桃体炎、尿路感染等疾病.该颗粒由地榆[8]、黄芩[9]、石榴皮[10,11]等中药组成.地榆具有凉血止血、解毒敛疮的功效，在止血、抗炎消肿、抗菌等方面发挥着重要的作用[12]；黄芩清热燥湿，泻火解毒，止血，亦可抗菌，在临床上广泛应用于治疗上呼吸道感染、肺炎及肺热引起的咳嗽[13]；石榴皮具有生津止渴、止泻止血等功效，具有抗氧化、清除自由基、保护消化系统等药理作用[14].

虽然榆芩颗粒具备较好的疗效与较小副作用，但作为医院制剂，存在提取工艺粗糙，制量标准不完善，使用范围小等不足之处.如该药现阶段质量标准检查这一项基本处于空白，而根据2015年版药典规定，复方制剂需使用高效液相色谱法测定其有效成分.此外，该制剂存在处方中药材的提取工艺未经过正交实验来优选[15-17]，有效成分是否被提取完全也不能确定[18,19]等问题.针对该制剂提取工艺上存在的问题，本文拟对提取工艺进行优选研究.

1 材料、试剂和仪器

高效液相色谱仪(Untimate3000，美国戴安公司)，分析天平(CP214，奥豪斯公司)，旋转蒸发仪(RE-52AA，上海亚荣)，循环水式真空泵(2XZ-1，上海双鹤)，真空干燥箱(DZF-6090，天津泰斯特仪器).

没食子酸(批号110831)、鞣花酸(批号111959)、黄芩苷(批号110747)购于中国食品药品检定研究院；药材石榴皮(批号2016001)、黄芩(批号20160702)、地榆(批号20160901)购于湖北天济饮片药业；石榴皮为石榴科植物石榴PunicagranatumL.的干燥果皮，地榆为蔷薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL的干燥根、黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，以上3种中药材均由中南民族大学药学院万定荣老师鉴定；甲醛、乙腈为色谱纯(Sigma)，其他试剂均为分析纯.

2 方法

2.1 指标成分含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱Agela Venusil MP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温保持30 ℃，流动相A相：乙腈；流动相D相：体积分数为0.2%的磷酸缓冲盐溶液，检测波长270 nm.采用梯度洗脱，调整流动相D相(磷酸缓冲盐溶液)的体积百分数，其方案如下：0～15 min，96% D；15～18 min，96%～81% D；18～34 min，81% D；34～36 min，81%～70%D；36～50 min，70%D.

2.1.2 对照品溶液的配置

称取黄芩苷、鞣花酸标准品20.0 mg、15.0 mg于10 mL容量瓶中，加入色谱级甲醇溶解并定容，得浓度为2.0 mg·mL-1的黄芩苷和1.5 mg·mL-1的鞣花酸对照品溶液；称取没食子酸标准品5.0 mg分别置于10 mL容量瓶中，加入蒸馏水溶解并定容，即得浓度为0.5 mg·mL-1的没食子酸对照品溶液.

2.1.3 样品溶液的配制

称取0.1 g的各组样品，放置在10 mL的容量瓶中，加入少量色谱级甲醇溶解，超声2 h，取出，放置冷却至室温，过滤，加入色谱级甲醇稀释，定容.

2.1.4 黄芩苷、没食子酸、鞣花酸对照品线性关系的考察

精密量取黄芩苷、没食子酸、鞣花酸对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶中稀释得到系列浓度.黄芩苷浓度为: 0.080、0.144、0.208、0.272、0.336、0.400 mg·mL-1; 没食子酸为: 0.020、0.036、0.052、0.068、0.084、0.100 mg·mL-1;鞣花酸为: 0.060、0.108、0.156、0.204、0.252、0.300 mg·mL-1.混合对照品溶液，以0.45 μm的有机系微孔滤膜过滤，进样10 μL至高效液相色谱仪中.按上述色谱条件测量3种有效成分的峰面积，以没食子酸对照品、黄芩苷对照品、鞣花酸对照品溶液的浓度(C，mg·mL-1)作为横坐标，峰面积(A)作为纵坐标制备各标准品的标准曲线.

2.1.5 方法学验证

1)专属性实验

分别取上述制备好的样品以及对照品溶液，按照上述色谱条件进行测定.

2)精密度实验

配制30、60、90 μg·mL-1的没食子酸溶液；180、360、540 μg·mL-1的黄芩苷溶液；60、120、180 μg·mL-1的鞣花酸溶液.微孔滤膜过滤后分别进样10 μL至高效液相色谱仪中，测定其峰面积(A)，1 d内测定3次，连续测定3 d，观察结果，计算RSD值，以考察仪器的精密性.

3)样品重复性实验

按“2.1.3”方法配制样品溶液，进样至高效液相色谱仪中，连续进样6针，测定峰面积计算没食子酸、鞣花酸和黄芩苷含量，计算RSD值，考察色谱条件是否可以重复.

4)样品稳定性实验

按“2.1.3”方法配制成样品溶液，按照色谱条件进样至高效液相色谱仪中，在0、12、24、36、48 h时分别进样一次，计算没食子酸、鞣花酸和黄芩苷含量，计算RSD值，考察仪器日内和日间的稳定性.

5)加样回收率试验

根据标准曲线计算样品中没食子酸、鞣花酸和黄芩苷的含量，再分别加入相当于样品溶液含量80%、100%、120%的标准品，同样品处理，测定其含量并计算RSD值.

2.1.6 浸膏得率的测定

对石榴皮、黄芩和地榆等药材按照因素水平表的方法进行提取，将所得滤液过滤，回收合并后用旋转蒸发仪浓缩至稠膏.水浴锅上挥干水分后在真空干燥箱中干燥至恒重，温度设置为60 ℃，根据以下公式计算收率：

干浸膏率=(干浸膏重量/药材总重)×100%

2.2 正交实验工艺优化

2.2.1 正交实验因素水平设计

以药材粒度(A)、乙醇浓度(B)、加醇量(C)和提取时间(D)为考察因素，对干浸膏收率、没食子酸、鞣花酸和黄芩苷含量为考察指标。每因素设置3个水平，采用L9(34)正交试验对榆芩颗粒的醇提工艺进行优选.实验因素水平如表1所示.

表1 正交实验因素水平

2.3 最佳工艺验证试验

按最佳提取工艺进行3次平行实验，分别测量其没食子酸、鞣花酸和黄芩苷含量以及干浸膏收率，以验证优选的方法是否为最佳工艺.

3 结果

3.1 方法学验证结果

3.1.1 线性关系考察结果

黄芩苷、没食子酸、鞣花酸线性关系见表2，线性关系良好.

表2 线性关系

3.1.2 专属性实验结果

如图1所示，没食子酸、鞣花酸和黄芩苷能达到很好的基线分离，且峰形良好；供试品中3种成分也能与其他组分能达到基线分离，分离度高于1.5，理论塔板均高于5000.且在同一色谱条件下供试品溶液与标准品峰色谱峰保留时间一致，表明该色谱条件专属性好.

a)供试品溶液，b)对照品；1)没食子酸；2)鞣花酸；3)黄芩苷

3.1.3 精密度实验结果

结果显示，没食子酸、鞣花酸和黄芩苷在不同浓度下其RSD%均小于2%，说明该仪器精密度良好(表3).

3.1.4 样品重复性和稳定性实验结果

根据测得的峰面积实验结果，计算RSD%，结果分别为0.31%、0.28%、0.09%(表4)，均小于2%，说明该仪器用于测定样品含量时，结果稳定且可信性度大.稳定性结果分别为3.3%、0.71%，1.20%(表4)，说明在2 d内样品溶液稳定性良好.

3.1.5 加样回收率实验结果

根据峰面积和回归方程求相应浓度，结果见表5，这3者平均回收率均在100%±5%之间，RSD%均小于5%，表明该法可以用于测定没食子酸、鞣花酸和黄芩苷的含量.

表4 样品重复性以及稳定性实验结果

表5 加样回收率实验结果(n=3)

3.2 正交实验结果

根据正交因素表进行实验，所得样品分别计算干浸膏收率，液相色谱法检测各指标含量.结果及方差分析结果如表6、7所示：(1)影响干膏收率的主次因素为C>A>D>B，药材粒度(A)、加醇量(C)对其有显著性影响(P<0.05)，最佳醇提工艺为A2B1C3D2；(2)影响没食子酸含量的主次因素为C>A>B>D，药材粒度(A)、醇浓度(B)、加醇量(C)对其有显著性影响(P<0.05)，最佳醇提工艺A3B3C1D1；(3)影响鞣花酸含量的主次因素为B>D>A>C，4个因素均对其无显著性差异(P>0.05)，最佳醇提工艺为A3B3C1D1；(4)影响黄芩苷含量的主次因素为D>C>A>B，加醇量(C)、醇提时间(D)对其有显著性影响(P<0.05))，最佳醇提工艺为A3B2C1D1.

从节约成本和时间的角度考虑，药材粒度选择A3，醇浓度为B3，加醇量为C1，醇提时间为D1.也就是最佳提取工艺为A3B3C1D1，即石榴皮单提，将药材粉碎为粗粉，第一次6倍量60%乙醇提取15 min，第二次4倍量60%乙醇提取10 min；其他药材的最佳提取工艺为将药材粉碎为粗粉，第一次6倍量60%乙醇提取1 h，第二次4倍量60%乙醇提取0.5 h，合并所有提取液后进行减压浓缩，干燥得浸膏.

3.3 最佳工艺验证

实验结果见表8，干膏收率为37.4%，没食子酸、鞣花酸和黄芩苷含量分别为4.6、18.5、35.4 mg·g-1，与正交实验结果基本一致，表明该工艺条件较为稳定，重复性良好.因此确定榆芩颗粒的最佳提取工艺为：药材粉碎为粗粉，乙醇浓度60%，提取2次，第一次6倍量乙醇、第二次4倍量乙醇，且石榴皮单独提取，第一次提取15 min、第二次提取10 min，剩余药材第一次1 h，第二次提取0.5 h，合并滤液，然后减压浓缩并干燥至衡重.

表8 验证实验结果

4 结语

采用四因素三水平的正交实验对榆芩颗粒的提取工艺进行了优选研究，并确定了最佳提取工艺.石榴皮主要成分为鞣质，是水溶性多元酚类化合物，能与蛋白质发生特征性反应，不宜长时间加热，实验证明石榴皮加热30 min以上，其有效含量无明显变化，所以从节能和省时考虑，石榴皮提取时间为15 min,因此石榴皮与其他药材分开提取.

以干浸膏收率、没食子酸、鞣花酸和黄芩苷含量作为指标，考察了药材粒度、乙醇浓度、加醇量、提取时间的影响，优选出榆芩颗粒的最佳醇提工艺.最佳工艺条件为: 药材粉碎为粗粉，乙醇浓度60%，两次提取，石榴皮单独提取，第一次6倍量乙醇提取15 min、第二次4倍量乙醇提取10 min；剩余药材第一次6倍量乙醇提取1 h，第二次4倍量乙醇0.5 h，合并所有滤液，然后减压浓缩.验证试验表明,该提取工艺稳定可行.