基于网络药理学的忧遁草治疗乙型肝炎的成分分析及作用机制研究

桑圣刚，张瑞，徐亚晨，桑贤正，肖曼

(1海南医学院 第一附属医院 检验科，海口 570102；2海南医学院 临床学院，海口 571199;3海军军医大学，上海 200433；4 海南医学院 基础医学院，海口 71199)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是世界范围内最严重的公共卫生问题之一.慢性HBV感染可导致肝纤维化，肝硬化和肝癌[1,2].针对乙型肝炎的深入研究和有效控制十分迫切.目前临床上针对乙型肝炎的抗病毒药物均存在一定的缺陷.海南地区民间及临床上治疗乙型肝炎均发现，南药忧遁草(Clinacanthusnutans)在抗HBV治疗上具有很好的功效，但目前其作用机制仍不明了.

忧遁草，又名沙巴舌草，鳄嘴花等，意为“延续生命”，是重要的传统医药[3].忧遁草一般以全株或叶片入药，味甘、辛、微苦，性凉，入肝、肾经，具有清热解毒、散瘀消肿、利湿利尿、活血疏经、解酒、抗肿瘤等功效.传统上用于治疗多种癌症、肝炎、黄疸、风湿痹痛、外伤跌打等.忧遁草为良好的慢乙肝引经药，可疏通人体郁结之肝气，增强了清热利湿、滋补肝肾的作用.本研究基于网络药理学理念，根据化合物结构特征预测潜在靶点，筛选建立忧遁草活性成分和乙型肝炎靶点相互作用的蛋白-蛋白相互作用网络图，运用网络药理学理念和相关技术手段，探索忧遁草治疗乙型肝炎的关键作用机制，为中草药抗病毒活性研究、改善常规抗HBV药物治疗乙肝的缺陷提供新的思路.

1 实验方法

1.1 忧遁草化学成分挖掘及分析

综合利用中草药成分查询数据库HIT(http://lifecenter.biosino.org/hit/)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、NPASS(http://bidd2.nus.edu.sg/NPASS)、TCM-ID(http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx)TCM@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)、TCMID(http://www.mega bio net.org/tcmid/search/)及中国知网、万方数据、维普中文期刊全文数据库、Pubmed、科学引文索引(SCI)等常用文献检索数据库检索忧遁草查询其所有化合物成分，检索词为“忧遁草”、“鳄嘴花”、“沙巴舌草”、“Clinacanthusnutans”、“you dun cao”等，将所有化合物名称整理成EXCEL表格.使用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)平台对各化合物分子结构进行确证，保存各化合物SMILES结构式、化合物2D、3D结果SDF文件备用.利用Linpinski 五规则查询化合物ADME信息，分析各化合物的类药性，具体内容包括分子量小于500 ；氢键供体数目小于5；氢键受体数目小于10；脂水分配系数小于5.符合Lipinski规则的化合物会有更好的药代动力学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度.如果化合物违背5规则(违背2项以上)，则该化合物很难成药.

1.2 忧遁草化学成分作用靶点预测

综合使用STITCH(http://stitch.embl.de/)、Swiss target prediction(http://swisstarget prediction.ch/)在线分析软件及TargetNet (http://targetnet.scbdd.com)QSAR模型靶点预测数据库，预测忧遁草中有效化学成分的作用靶点，并将结合分数大于0.5的大分子蛋白作该成分的有效靶点，提取作用靶基因名称构建忧遁草化学成分靶点交互作用网络.

1.3 忧遁草“成分- 靶点”网络构建

应用在线OMIM(https://omim.org/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)、GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)常用疾病基因数据库获取乙型肝炎相关基因.多数据库检索已报道的乙型肝炎相关蛋白，提取80%以上疾病基因，作为疾病特异性靶基因.通过对于忧遁草有效成分的靶蛋白及乙型肝炎疾病靶点交叉分析，获取忧遁草治疗乙型肝炎的核心靶点，使用 Cytoscape 软件(Version3.6.1, http: //www.cytoscape.org)构建药物-成分-靶点关系网络.整个网络展示成分-靶点之间的联系，通过构建这一网络探析忧遁草治疗乙型肝炎的作用机制.

1.4 忧遁草治疗乙型肝炎蛋白质交互作用网络(PPI)

将忧遁草的类药活性成分所映射的靶基因和乙型肝炎相关的疾病基因进行维恩分析，获得两者的交叉共同基因即为忧遁草治疗乙型肝炎的核心靶点.将忧遁草治疗乙型肝炎的靶点导入STRING(https://string-db.org/)及 GeneMANIA(http://genemania.org/)蛋白质交互作用网络分析网站，构建忧遁草治疗慢性乙型肝炎蛋白质交互作用网络.

1.5 忧遁草治疗乙型肝炎GO分析与KEGG分析

生物信息数据库DAVID整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表(成百上千个基因ID或者蛋白ID列表)提供系统综合的生物功能注释信息，并可进行基因本体(GO)分析和KEGG通路分析，借此挖掘特定基因或蛋白的生物学意义.将关键靶点基因输入David数据库功能注释工具中(Version 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)，GO富集分析选择生物过程(biological process)，分子功能(molecular function)，和细胞组成(cellular component)3 个模块，通路分析选择 KEGG，设定P<0.05 以确定关键靶点富集通路.使用OMICshare将富集结果绘制成高级气泡图(图5).

2 结果

2.1 忧遁草化学成分挖掘及分析

经数据库检索整理共获得忧遁草化合物59种，将名称整理成EXCEL表格使用PubChem平台对各化合物分子结构进行确证，保存化合物SMILES结构式，在线分析平台TargetNet查询化合物Linpinski 五规则，ADME信息，分析各化合物的类药性，筛选出五规则符合度高于75%的27种化合物作为进一步分析的类药化合物.化合物信息见表1.

表1 忧遁草27种类药性化合物信息

2.2 忧遁草化学成分作用靶点预测

使用STITCH、Swiss target prediction在线分析软件及TargetNet QSAR模型靶点预测数据库，预测忧遁草中有效化学成分的作用靶点，获得27种类药成分靶点共1758个，筛选成分-靶点结合分数>0.5的靶基因，共获得271个兴趣基因，应用在线OMIM、DisGeNET、GEO常用疾病基因数据库获取乙型肝炎相关基因.多数据库检索检索已报道乙型肝炎相关蛋白，提取80%以上疾病基因，获得乙型肝炎疾病特异性靶基因282个，将药物兴趣基因与疾病特异性靶点进行维恩分析，获得关键靶基因20个，分别为TNF、CASP9、APOBEC3G、IKBKB、TGFBR1、PTPRC、CASP3、MAPK10、AR、HNF4A、RELA、RARB、CDK2、AKT1、MET、PIK3CG、PIK3CA、BCL2、PIK3CB、PIK3CD.结果如图1所示.

图1 忧遁草类药成分靶基因与乙肝疾病基因维恩分析

2.3 忧遁草“成分- 靶点”网络构建

将获得的20个关键靶基因映射所属类药成分，发现27种类药成分中有16种成分参与对关键靶基因的调控，构建成分-靶点关系对文件，使用Cytoscape软件构建成分-靶点关系网络图，通过节点属性可知连接度前三位的成分分别为isovitexin、beta-Sitosterol、phytol，这可能为忧遁草治疗乙型肝炎的关键化合物.结果见图2.

2.4 忧遁草治疗慢性乙型肝炎靶点蛋白质交互作用网络

将忧遁草治疗乙型肝炎的靶点导入STRING及 GeneMANIA 蛋白质交互作用网络分析网站，构建忧遁草治疗慢性乙型肝炎蛋白质交互作用网络PPI文件，利用Cytoscape 软件进行关键节点分析，通过节点连接度大小呈现关键靶基因的权重，使用节点大小及颜色深浅凸显靶基因在乙肝疾病治疗中的不同作用，共获得20个节点，68个相互关系，其中TNF、AKT1、PIK3CA、CAS3、CAS9处于节点关键位置，表明它们是治疗疾病的核心蛋白.具体结果见图3.

绿色为关键靶基因，红色为有效成分

通过颜色深浅与形状大小显示出Hub节点

2.5 忧遁草治疗乙型肝炎GO分析与KEGG分析

使用DAVID 进行基因本体(GO)分析和 KEGG 通路分析.将关键靶点基因输入David数据库，然后进行GO富集分析KEGG通路分析.使用OMICshare将富集结果绘制成高级气泡图.关键基因GO功能富集如结果图4(a)显示，KEGG 富集出80条通路，去除广泛通路后，如图4(b)显示，排名靠前的主要相关信号通路如下：乙型肝炎疾病通路、癌症通路、凋亡信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等.富集结果显示忧遁草有效成分呈现出通过多靶点多通路达到治疗乙型肝炎的可能性.其中作用于乙型肝炎疾病通路的富集结果显示，化合物通过PI3K/AKT、MAPK、NF-kappa B等免疫或炎症途径对乙肝疾病的进展产生影响(图5).

图4 关键基因GO富集分析(a)与KEGG pathway富集分析(b)

3 讨论

当前研究普遍认为HBV感染慢性化的关键机制是机体对HBV产生了特异性的免疫耐受.目前临床上抗HBV主要使用干扰素类、核苷类和中成药等药物[4，5],但整体呈现出或总体疗效不佳，或不良反应多，亦或导致耐药性等问题[6，7].中草药作为天然药物呈现出抗病毒疗效更佳、副作用更小的鲜明特点[8].

忧遁草可能为很好的抗乙肝药物.本研究中药物-成分-靶点网络显示，忧遁草主要活性成分异牡荆素(isovitexin)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、叶绿醇(phytol)为网络中的重要节点，提示它们在忧遁草对乙肝治疗中发挥着重要作用，这与目前的相关研究结果存在很大一致性，证明了虚拟结果的可靠性较高.

图5 乙型肝炎疾病信号通路基因显著富集图

研究表明忧遁草氯仿提取物在体外对多种癌细胞显示出显著的抗增殖作用[9].另外，忧遁草增强了CD8+T细胞在炎性或肿瘤细胞的浸润，激活了CD8+T细胞的功能[10].异牡荆素是很多中草药的活性成分[11].异牡荆素具有抗炎、抗氧化活性及抗阿尔茨海默病的作用[12]，异牡荆素还具有抗肝癌、乳腺癌和结肠癌的活性[13].β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低胆固醇、抗肿瘤等功效[14].叶绿醇衍生物可通过诱导一系列趋化因子和细胞因子的表达而发挥免疫刺激活性从而调节免疫应答[15].这些初步研究提示出忧遁草对于机体免疫功能的调节与恶性肿瘤的防治有功效，具有极大的成药潜力与研究价值.

以上结果说明忧遁草可通过多成分、多靶点的协同作用而充分发挥作用，为中药多组分多靶点作用的挖掘与研发提供了新思路，也为目前鲜有报道的活性成分指明未来深入研究的方向.研究得到忧遁草治疗乙肝的关键靶点基因20个，进一步的蛋白质相互作用网络分析显示TNF、AKT1、PIK3CA、CAS3、CAS9这5个关键靶点在网络中具有重要地位，提示其可作为忧遁草治疗乙肝的核心靶点.

肿瘤坏死因子(TNF)是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子.TNF对病毒清除至关重要，TNF有多种途径发挥抗病毒活性[16-19].PI3K/Akt信号通路是细胞内外信号转导一个重要纽带, 在细胞抗凋亡、增殖、分化以及侵袭转移中起到至关重要作用[20].PIK3CA是属于PI3K-Akt信号通路中的一个关键原癌基因，蛋白激酶B(AKT1)也是该通路重要分子.caspase家族是一组具有相似氨基酸序列、结构和功能的蛋白水解酶，是细胞凋亡的主要执行者.caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒性T细胞(CTL)杀伤机制的重要组成部分，提示caspase 9蛋白低表达可能导致细胞凋亡机制障碍，细胞增殖失去控制，从而参与肝癌的发生和发展过程，并与肝细胞的恶性转化和浸润转移相关[21].

GO注释结果显示，关键靶点涉及的细胞成分为影响细胞质的功能，分子功能主要为干预1-磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、类固醇激素受体活性及影响ATP结合过程.生物过程包括肽基丝氨酸磷酸化的调节、NF-Kappa B转录因子活性调节、外源性凋亡信号通路的调控、葡萄糖代谢过程、细胞增殖、蛋白激酶B(AKT)过程的调节、RNA 聚合酶II 启动子转录及基因表达调控等多个层面发挥作用.这些生物学过程在药物活性成分抗炎抗病毒机制的发挥及靶点所涉及的通路都有所体现.

此外，研究中药物关键靶点主要富集的通路为乙型肝炎疾病通路、癌症通路、凋亡信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等.这些通路都与炎症的发生发展乃至恶性癌变的过程高度相关，通路富集的结果表明忧遁草的活性成分作用的核心靶点映射于不同的通路，可通过各通路协调共同发挥药效，这与目前对靶点基因的相关研究结果及药物活性成分所能作用的通路基本一致，也为更进一步的机制研究指明方向.

对忧遁草的多成分、多靶点与乙肝疾病间的多元网络关系的研究结果初步表明了忧遁草主要潜在活性成分及作用靶点、作用病种及相关通路，为进一步深入探讨其作用机制提供了新思路，但仍需进一步的基础研究与临床实验为虚拟预测结果作支撑.