藻菌共生系统处理猪粪废水的研究

王海英，梅毅强，范琪，安达,韦嘉璐，刘柑杏

(中南民族大学 生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

畜禽养殖业规模化产生大量畜禽排泄物和各种废弃物，畜禽养殖污染成为继工业和生活垃圾污染后的第三大污染源[1].微藻可吸收废水中无机氮和磷的营养物质，通过光合作用合成生物燃料、食物、药物和化学品的原料[2]，是低成本生产微藻生物质的高度可持续性过程，被认为是解决能源与环境问题的理想技术[3].

近年来研究藻菌共生系统处理废水较多，并取得一定的效果，认为它可作为废水二、三级处理的替代方法[4].DE-BASHAN等[5]采用促进小球藻生长的巴西固氮螺组成藻菌联合体系，对城市污水中的氨氮、硝酸盐氮和磷的去除效率分别达到100%, 15%和 36%，显著高于纯藻系统.JI等[6]比较了两种藻菌共生系统对合成废水的处理，发现小球藻和地衣芽孢杆菌共生系统去除效果较好，化学需氧量(COD)、总氮(TN)、总磷(TP)去除效率分别为86.55%，80.28%和88.95%；而铜绿微囊藻和地衣芽孢杆菌共生系统去除效率仅为65.62% COD，70.82% TDP和21.56% TDN.LIANG等[7, 8]将地衣芽孢杆菌和C.vulgaris构建藻菌共生体系，藻与细菌的细胞密度比例为1∶1时氨氮(NH3-N)去除效率提高至78%，且系统pH值的变化会极大影响系统对营养物的去除效率.这些研究说明藻菌共生系统对废水的转化效率不仅与系统中藻和菌的种类有关，且与藻菌共生系统的外部环境条件有关.

芽孢杆菌对碳系、氮系、磷系污染物具有较强的分解能力，可将氨离子转化为含氮物质，将磷转化为磷酸盐储存在细胞内[9]，对废水中的有机物有较强的转化能力，在废水处理中广泛使用[10]，前期研究发现小球藻、莱茵衣藻等绿藻对废水具有着良好的净化作用，生长速度快，处理废水周期短[11,12]，本文基于对适应猪粪废水生长的芽孢杆菌的筛选，与莱茵衣藻建立藻菌共生系统，考察该系统对猪粪废水的净化的加强，并通过添加少量葡萄糖和芽孢杆菌萌发剂丙氨酸，探讨促进藻菌共生系统产生协同作用达到猪粪废水高效率转化的条件.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

菌种：蜡样芽胞杆菌(BacilluscereusYS,BacilluscereusSLK)、凝结芽孢杆菌(BacilluscoagulansBS32,BacilluscoagulansBS33)、短小芽孢杆菌(BacilluspumilusBSK9)、地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisBL20368,BacilluslicheniformisZCS,BacilluslicheniformisBS30)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,BacillussubtilisMA139,BacillussubtilisR-179,BacillussubtilisBS20,BacillussubtilisC-3102,BacillussubtilisBS24)由中南民族大学生命科学院生物工程实验室提供.藻种：莱茵衣藻(ChlamydomonasreinhardtiiFACHB-2217)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供.COD试剂(1.14538.00065和1.14539.00495，WTW，德国);C6H8O6抗坏血酸(国药集团化学试剂);(NH4)6Mo7O24·4H2O(重庆北碚化学试剂厂).

消解装置(XJ-III, 韶关市泰宏医疗器械);紫外可见分光光度计(752型,上海光谱仪器);全温摇床(QYC,上海新苗医疗器械);光学显微镜(Motic BA210,厦门麦克奥迪电气);水质分析仪(Photo Lab S6, 德国WTW).

1.2 藻种和菌种的培养

芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，主要成分：10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，3 g/L牛肉膏，37 ℃恒温培养箱中200 r/min培养24 h即可.莱茵衣藻用TAP培养基进行培养，主要成分：2.42 g/L Tris base，10 mL/L TAP-salts溶液(37.5 g/L NH4Cl，10 g/L MgSO4·7H2O,7 g/L CaCl2·2H2O)，1 mL/L磷酸缓冲液(27 g/L K2HPO4,18.5 g/L KH2PO4)，1 mL/L微量金属元素[50 g/L Na2EDTA，22 g/L ZnSO4·7H2O，5.06 g/L MnCl2·4H2O，0.05 g/L CaCl2·2H2O，11.4 g/L H3BO3，4.99 g/L FeSO4·7H2O，1.10 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O，1.61 g/L CoCl2·6H2O，1.57 g/L CuSO4·5H2O和16 g/L KOH]，1 mL/L冰醋酸，取对数生长期的莱茵衣藻接种后在温度为25 ℃，3000 lux的光照培养箱中培养.

1.3 猪粪废水预处理

畜禽猪粪废水取自华中农业大学养猪场.取适量的水稀释猪粪废水，静置12 h沉淀，取上清，以10 g/L壳聚糖为絮凝剂(体积比6%)，10 g/L海藻酸钠(体积比3%)为助凝剂进行絮凝处理后，上清液即为实验所需的畜禽猪粪废水，测定废水各指标的范围见表1.实验时用自来水将其稀释至COD初始浓度约为 1000 mg/L，并高温灭菌，每组实验使用同一批废水.

表1 猪场废水测定值

1.4 藻菌共生系统的构建

分别将培养至对数生长期的藻液和菌液取出，8000 r/min离心5 min后，弃上清(避免培养基对水质测量的干扰)，用经过稀释的灭菌畜禽猪粪废水重悬后，分别将莱茵衣藻 (8.75×106细胞/mL,体积比10%)和芽孢杆菌 (7.63×108细胞/mL, 体积比1%)接入灭菌的畜禽猪粪废水中，光照40～50 μmol/m2·s，25 ℃，150 r/min摇床连续培养5 d，取10 mL培养液8000 r/min离心5 min后，取上清作为样品进行水质检测.

1.5 水质的测定

1.5.1 COD试剂盒法测定

将COD试剂A、COD试剂B和水样按照量程内的试剂比例加入到COD消解管中，水样为样品经过6000 r/min离心10 min后的上清液，移取上清液3 mL于消解管中，消解装置中加热到140 ℃消解2 h后，自然冷却到室温，将COD消解管放入水质分析仪中测量水样中COD 含量.

1.5.2 NH3-N,TN,TP含量的测定

将样品 6000 r/min，离心10 min后，取上清液进行NH3-N,TN, TP含量的测定.监测方法依照水质测定国家标准方法：水质总氮的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，GB/T 11894—1989；水中氨态氮采用标准测试方法，ASTM D1426—2003；水质总磷的测定采用钼酸铵分光光度法，GB/T 11893—1989.

1.6 数据分析

所有实验均进行至少3次平行实验，结果数据使用GraphPad prism 5.1分析软件分析样本的差异显著性，采用One way-ANONA分析.

2 结果与分析

2.1 适宜在猪粪废水中生长的芽孢杆菌的筛选

14株芽孢杆菌均为中南民族大学生物工程课题组筛选的益生菌.将14株芽孢杆菌培养于初始COD浓度 1000 mg/L畜禽猪粪废水中，24 h后以猪粪废水做参比，测得600 nm处的浊度如表2所示，得到生长较为明显的有蜡样芽胞杆菌B.cereusYS，凝结芽孢杆菌B.coagulansBS32，蜡样芽胞杆菌B.cereusSLK和短小芽孢杆菌B.pumilusBSK9，但浊度值仅为0.4～0.5，说明芽孢杆菌对猪粪废水中复杂有机物的同化能力有限.筛选这4株菌为后续实验对象，与C.reinhardtiiCC-125构成藻菌共生系统，研究这4个系统对畜禽猪粪废水中NH3-N, TN, TP, COD的去除效率.

表2 猪粪废水中芽孢杆菌的浊度

2.2 藻菌共生系统对猪粪废水水质的去除效果

图1为4个藻菌共生系统在高浓度畜禽猪粪废水中各指标的去除效率，以纯藻系统作为对照.图1a显示3个藻菌共生系统对NH3-N的去除效率的提升并不显著，而凝结芽孢杆菌B.coagulansBS32和C.reinhardtiiCC-125共生系统对NH3-N的去除效率比纯藻系统降低了16.07% ；图1b中B.coagulansBS32与C.reinhardtiiCC-125共生系统对TN的去除效果显著(P<0.01)，比纯藻系统提高了22.66%，而其他三组系统对TN的去除较差；图1c显示4个藻菌共生系统与纯藻系统相比，对TP的去除效果均降低约20%；图1d中 4株藻菌共生系统对COD的去除有促进，但未表现出显著的去除效果.综上所述，藻菌共生系统对初始COD浓度1000 mg/L的畜禽猪粪废水中对各指标的去除效率并未表现出明显的优势.

1)CC-125; 2)CC-125 with YS; 3)CC-125 with SLK; 4)CC-125 with BSK9; 5)CC-125 with BS32与纯藻系统相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

2.3 添加葡萄糖藻菌共生系统对猪粪废水的去除效果

与纯藻系统相比，芽孢杆菌与莱茵衣藻共生系统未表现出对畜禽猪粪废水净化的优势，是由于芽孢杆菌在猪粪废水中的生长受限.在猪粪废水中添加0.5 g/L葡萄糖促进芽孢杆菌在处理过程中的生长，以积累菌体并发挥芽孢杆菌分解复杂污染物的作用，结果见图2.图2a中，添加0.5 g/L葡萄糖显著提高了NH3-N去除效率(P<0.001)，藻菌共生系统对NH3-N去除效率均有不同程度的提高，其中B.cereusYS和C.reinhardtii共生系统对NH3-N去除效果最显著，去除效率提高了19.63%；图2b显示所有藻菌共生系统与纯藻系统相比，对TN的去除效率均有不同程度的提高，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系统对TN的去除效率提高最为明显，提高了28.4%；图3c显示各共生系统对TP的去除效果相较于纯莱茵衣藻均有提高，约为10%；图3c为COD的去除效率，添加葡萄糖后藻菌共生系统显著提高(P<0.001)，其中B.coagulansBS32及B.cereusYS分别和C.reinhardtii组成的共生系统对COD的去除效率的提高均达到20%以上.综上添加0.5 g/L葡萄糖显著促进了废水污染的去除效果，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系统各指标的去除效率提高最为显著，添加少量葡萄糖有效促进了藻菌共生系统对畜禽猪粪废水的净化.

2.4 藻菌共生系统添加葡萄糖和丙氨酸处理猪粪废水

芽孢杆菌在营养不充足的情况下会形成芽孢进入休眠，而L-丙氨酸具有促进芽孢的萌发[14]，实验同时添加少量丙氨酸和葡萄糖到猪粪废水中，藻菌共生系统对畜禽猪粪废水的处理效果结果见图4.由图4可见：与相同条件下的纯藻系统相比，各共生系统较纯莱茵衣藻对NH3-N去除效率增长了约18%；B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系统对TN的去除效率较显著(P<0.001)，较纯莱茵衣藻去除效率显著提高了39.5%；藻菌共生系统对TP去除效率也显著提高(P<0.001)，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系统提高最显著，较纯莱茵衣藻提高了19.84%；各共生系统对COD去除效率提高显著，均达到约80%，但4个系统对COD的去除效率差异并不明显.综上，同时添加丙氨酸和葡萄糖较单独添加葡萄糖对废水污染的去除效率显著提高.其中B.coagulansBS32和C.reinhardtii共生系统各指标的去除效率提高最为显著，说明微量丙氨酸和葡萄糖可显著促进废水中污染物的去除效率.

1)CC-125; 2)CC-125 with YS; 3)CC-125 with SLK; 4)CC-125 with BSK9; 5)CC-125 with BS32与纯藻系统相比, ***P<0.01

1)CC-125; 2)CC-125 with YS; 3)CC-125 with SLK; 4)CC-125 with BSK9; 5)CC-125 with BS32与纯藻系统相比, **P<0.01, ***P<0.001

3 结语

本文筛选出4株能够在猪粪废水中生长的芽孢杆菌(BacilluscereusYS,BacilluscereusSLK,BacilluspumilusBSK9,BacilluscoagulansBS32),并分别与C.reinhardtiiCC-125构成藻菌共生系统对猪粪废水进行处理.在原始猪粪废水中 4个藻菌共生系统对NH3-N, TN, TP, COD的去除效率未表现出优势；添加0.5 g/L葡萄糖后，藻菌共生系统的净化效果均优于纯藻系统，B.coagulansBS32和C.reinhardtiiCC-125共生系统的去除效率提高最为显著，对NH3-N, TN, TP, COD的去除效率较纯藻系统相比分别提升了16.58%, 28.38%, 8.90%, 23.04%.猪粪废水中同时添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L丙氨酸后，4个藻菌共生系统对污染物质的去除效率进一步提高，其中B.coagulansBS32和C.reinhardtiiCC-125共生系统的去除效果提升较显著，对NH3-N, TN, TP, COD的去除效率较纯藻系统分别提升了18.16%, 39.51%, 19.84%和39.56%，故添加葡萄糖和丙氨酸可以有效促进藻菌发挥协同作用，提高对猪粪废水的处理效率，有助于藻菌共生系统对畜禽猪粪废水的净化.