生物分离用超顺磁微米颗粒的特征及制备

刘冬，龙高波

(1.重庆市南川区人民医院药剂科，重庆 408400；2.重庆博蓝鹰生物技术有限公司，重庆 401332)

Fe3O4或γ-Fe2Ο3纳米粒子具有超顺磁性，称纳米磁芯。有机物或无机物和此类超顺磁纳米磁芯复合所得0.1～10 μm左右的颗粒称超顺磁亚微米颗粒(paramagnetic submicron particles，PMSP)[1]。无外加磁场时，PMSP中纳米磁芯极性随机化而无磁性，在外加磁场下磁芯定向排列而呈现磁性和定向运动。在PMSP表面固定生物活性分子，通过这些固定化生物分子的亲和作用选择性结合混合物中特定成分，用外部磁场产生的磁力选择性分离复合物，从而选择性分离出所结合的成分，此过程称生物亲和磁分离[2]；该技术依赖亲和作用及磁力分离，其操作简便、设备易得、高效，尤其分离过程中不引入新的化学物质，这使得磁分离技术成为分离及分析的核心技术，广泛用于生物医药领域，包括全自动化学发光免疫分析[3]、全自动核酸检测[4]、配体混合物组合库集群筛选[5-6]、固定化酶用于生物催化合成[7]。因此，PMSP是医药生物技术的一个研究热点。

样品中非目标成分在功能化PMSP表面结合称非特异吸附(nonspecific adsorption)。功能化PMSP的非特异吸附、磁响应速度、结构稳定性、悬浮稳定性/单分散性和固定生物分子的活性决定其应用价值。功能化PMSP表面结构决定其非特异性吸附，同时影响PMSP颗粒间相互作用、单分散状态和悬浮稳定性。PMSP内部结构决定其磁响应速度、结构稳定性和悬浮稳定性。PMSP表面用于固定化生物分子的高反应活性基团性质决定了生物分子固定化方式及固定后活性的保留比例，颗粒表面此类基团的总量决定了生物分子固定化容量。可见，PMSP的内部结构及包括表面高反应活性基团性质在内的表面结构是其应用价值的决定因素，制备PMSP时需同时考虑多方面因素的优化。

磁力驱动分子在体内定向运动后靶向释放药物、磁分离分选细胞及磁信号作为标记物[8]，都要求粒径在100 nm以内磁颗粒即纳米磁珠。生物医药应用对PMSP和纳米磁珠性能要求有差异。现就生物分离应用对PMSP性能要求及其制备与表征方法作一综述。

1 PMSP表面的非特异吸附

PMSP在应用时需维持单分散状态使其表面所固定生物分子发挥作用，且非特异吸附足够低而悬浮稳定性好。理论上，固定化生物分子后PMSP剩余表面仍可非特异吸附溶液中成分，这种剩余表面相互接触还会造成PMSP聚集团聚而降低悬浮稳定性。在生物亲和磁分离中，非特异吸附会显著提高来自非目标分子的本底信号而降低分析灵敏度。PMSP表面对混合物中目标分子特异结合与对非目标分子的非特异吸附的比值(信噪比)是PMSP应用价值的关键指标。显然，要提高PMSP应用价值，其表面非特异性吸附应尽可能低，固定化生物分子密度尽可能高，固定化生物分子比活性尽可能接近游离状态。现有方法制备的PMSP，其表面对来自生物样品的很多成分都有较强非特异吸附。对PMSP进行表面修饰改性是降低PMSP非特异吸附的关键策略。聚集的PMSP悬浮稳定性显著降低而妨碍所固定化分子的活性，表面修饰覆盖抗聚集成分也有利于抗聚集和提高PMSP悬浮稳定性。可见，表面修饰改性方法是制备PMSP的关键技术之一。

生物样品中，在PMSP表面发生非特异吸附成分包括大分子和小分子两类，现有方法制备的PMSP表面都有一定疏水性，而疏水相互作用是各类物质非特异吸附的关键机制和发生聚集的关键作用力，增加PMSP表面亲水性成为降低其非特异吸附的重要途径。因此，用亲水修饰剂对表面进行修饰改性是制备PMSP的关键技术之一。蛋白和核酸是来自生物亲和磁分离样品的主要大分子成分。核酸在有机聚合物包裹PMSP表面非特异吸附一般较低。膜蛋白在PMSP表面很容易发生非特异吸附且难以解决；水溶性蛋白质因其特殊的构象，也容易在PMSP表面发生非特异吸附。用强亲水修饰剂对PMSP表面修饰改性是降低PMSP表面对水溶性蛋白质非特异吸附和抗PMSP聚集的关键策略；这类强亲水修试剂包括聚乙二醇[9]、两性离子化合物/聚合物[10-13]及天然生物大分子三类。理论上，用强亲水物质为单体聚合包裹纳米磁芯制备PMSP，有望同步实现制备和表面修饰，但其所需单体在设计和制备过程很难同时满足聚合和修饰功能而无法达到预期效果。因此，制备PMSP后再用强亲水修饰剂对其表面修饰改性仍是主要策略。

肝素和清蛋白是天然生物大分子修饰剂的代表[14]，但其与样品中成分产生非预期的特异相互作用，且此类修饰剂稳定性低，尤其这两类蛋白对PMSP表面进行亲水修饰后很难固定化生物分子，故应用受限。聚乙二醇是中性亲水物质，其分子量越大则修饰后对降低PMSP表面的非特异相互作用越显著，越有利于维持单分散状态。但长链聚乙二醇分子量大，官能基团少且处于两端，能够固定在PMSP表面的量太少，无法显著降低PMSP表面的非特异性吸附；用短链聚乙二醇修饰对降低PMSP表面非特异相互作用的效力太弱。用小分子两性离子化合物修饰PMSP降低非特异相互作用很有吸引力，但此类修饰剂体积小，必需有很高修饰度才能封闭PMSP表面的疏水位点，而现有修饰工艺很难保障修饰度。因此，需综合考虑成本和效力，制定PMSP表面用亲水物质修饰的综合性策略。

测定PMSP表面对水溶性蛋白的非特异性吸附需选择模型蛋白和高灵敏度定量方法，所用模型蛋白吸附状态检测信号要与游离状态相同或更高。洗脱吸附蛋白后变性电泳并染色显示能表征PMSP表面非特异吸附，但其灵敏度低且只能定性。用吖啶酯标记三种模型蛋白(亲和素、牛血清多抗和牛纤维蛋白原[15])，测定磁分离吸附蛋白的化学发光信号能高灵敏度测量PMSP的非特异吸附。用此方法发现Thermo Fisher Scientific的Dynal M280-链亲和素结合生物素化山羊抗PTH多克隆抗体后，复合物对上述三种模型蛋白的非特异性吸附都低于0.1%。这类测定方法灵敏度高，但成本高。用吸附在PMSP 表面后活性不降低的水解酶为模型蛋白，分离吸附的水解酶后测定PMSP吸附酶的活性，是测定PMSP表面非特异吸附更简便的定量技术[16]。

小分子化合物的疏水性是其在PMSP表面非特异吸附的主要驱动力。4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯的LogP约4.0且便于反相HPLC测定；用此化合物为模型，发现用2种聚乙二醇不饱和酸单酯共聚合包被Fe3O4制备PMSP的非特异吸附很低[17]。但选用LogP接近6.0的4-硝基-1-萘酚辛酸酯，则此类PMSP表面的非特异性吸附仍很强[18]。这说明用聚乙二醇不饱和酸酯聚合包裹所得PMSP仍不适合筛选配体混合物组合库。

目前生物医药应用的PMSP几乎全部依赖于进口。传统的方法是用磁珠先偶联功能分子(链亲和素，抗体等)后再用白蛋白进行封闭来降低磁珠表面的非特异性吸附，此方法能非常显著的降低非特异性吸附，用于科学研究没有问题，但在要求灵敏度更高的发光免疫领域依然无法胜任；更简单适用且低成本的PMSP表面修饰技术仍然是制备PMSP的关键技术之一[19]。

2 磁响应速度

PMSP的磁响应速度是全自动分析测试速度的决定性因素。PMSP表面应有固定化生物分子所需有机官能团；有机单体和纳米磁芯共聚合是制备PMSP的基本策略。制备过程中，常需先将纳米磁芯用表面活性剂分散而防止聚集，以便获得纳米磁芯含量均匀的颗粒；纳米磁芯用表面活性剂稳定分散所得超顺磁胶体称磁流体[20]。将磁流体和所选有机单体分散均匀后再聚合包裹是制备PMSP的基本策略。相应地，所得PMSP的磁响应速度取决于其所含磁流体的比饱和磁化率及磁流体质量百分比两个因素，同时也受PMSP形状、粒径大小、粒径均一性和表面性质等因素的影响。PMSP中磁流体比饱和磁化率越高、所含磁流体质量比例越大，无疑其磁响应速度越快。但PMSP中磁流体含量越高则其密度必然很高，所得PMSP的悬浮稳定性也就越低。故提高磁流体的比饱和磁化率对提高PMSP磁响应速度更有价值。

2.1 制备高比饱和磁化率磁流体的常用策略

制备磁流体方法包括物理法和化学法两大类。化学法工艺简单，设备要求低，粒径易于控制，其又可分为共沉淀法、高温热分解法、水热合成法及微乳液法等。现有方法所得Fe3O4磁流体的比饱和磁化率通常接近60 emu/g[21]。亚微米磁簇通过多个单畴磁性纳米晶体的偶极相互作用提高了其磁饱和强度和磁响应性。近年来合成超顺磁性亚微米磁簇的报道越来越多[22-24]。亚微米磁簇虽有很高的磁响应性，但其尺寸大于临界超顺磁尺寸，所以其粒子本身剩磁不为零，在水中容易聚集而应用受到限制。

2.1.1 共沉淀法制备磁流体 共沉淀法是制备磁流体最常用的方法，所制备的Fe3O4磁流体粒径及磁响应性能稳定，比饱和磁化率通常可达60 emu/g。共沉淀法所得磁流体的磁响应性能影响因素很多[25]。Qiu等[26]发现共沉淀体系加入1 M的NaCl后所得Fe3O4粒径可减小约1.5 nm，但其饱和磁化强度由71 emu/g降低到63 emu/g。共沉淀法所得Fe3O4微粒晶体结构不完整而比饱和磁化率低，经加热处理熟化后晶体结构完善而比饱和磁化率显著提高；熟化过程促进了Fe3O4颗粒中杂质熔解分离，提高Fe3O4颗粒纯度进而提高比饱和磁化率。熟化温度一般在70～90 ℃，温度过高会造成Fe3O4氧化而使得磁性下降。特殊的是，用反滴定化学沉淀法制备的Fe3O4磁流体比饱和磁化强度能达到104 emu/g[27]。

2.1.2 高温热分解法制备磁流体 高温分解法以铁的有机物作为前驱体热分解成铁原子，再由铁原子生成铁纳米粒，通过控制氧化等途径制备纳米铁氧化物。该法制备Fe3O4纳米颗粒分散性好，晶型完整，粒径均一。以乙酰丙酮铁为前驱体，在二苯醚和乙醇分散体系中以油胺和油酸作为稳定剂，热分解制得粒径为4 nm的Fe3O4纳米粒，比饱和磁化强度高达82 emu/g[28-32]。

2.1.3 溶剂热法制备磁流体 溶剂法是采用高沸点极性有机溶剂作为反应介质，铁盐作为铁源，加入碱，在高于溶剂沸点的温度下，生成亚微米磁性粒子或磁簇。用乙二醇作为溶剂和还原剂，醋酸钠和聚乙二醇为稳定剂，将六水合三氯化铁在高压釜中加热到200 ℃反应得到粒径从200 nm到800 nm的磁性颗粒(图1)，比饱和磁化率接近 82 emu/g[33]。乙二醇作为溶剂和还原剂，无水三氯化铁作为铁源，柠檬酸钠和无水乙酸钠为稳定剂，在高压反应釜内200 ℃反应10 h，得到粒径从80 nm到410 nm水溶性更好超顺磁Fe3O4磁簇 (图2)，比饱和磁化率接近 80 emu/g[34]。用一缩乙二醇作为溶剂和还原剂，无水三氯化铁作为铁源，聚丙烯酸作为稳定剂，并加入氢氧化钠，在反应釜中220 ℃反应1 h，得到粒径从31 nm到174 nm水溶性更好的超顺磁Fe3O4磁簇，比饱和磁化率接近 64 emu/g[35-36]。

2.2 提高纳米磁芯比饱和磁化率的特殊策略：无机金属离子掺杂

常见方法所得Fe3O4纳米颗粒的饱和磁化率很难超过80 emu/g[37]。Fe3O4顺磁颗粒有特殊晶格且晶格内有间隙。某些杂离子以填充方式进入这些晶格空隙，能改变所得超顺磁颗粒的饱和磁化率。将少量NiO掺杂入Fe3O4粉体中进行高温煅烧后可提高Fe3O4的磁化率[38]。用化学沉淀法所得Ni掺杂Fe3O4纳米粉末，其饱和磁化率达到114 emu/g[39]。

2.3 PMSP中磁流体含量

提高PMSP中纳米磁芯的质量比例/含量是提高PMSP磁响应性的关键[40]。在使用单体共聚合包裹磁流体制备PMSP的策略中，尽可能增加磁流体量并严密包裹是制备结构稳定且高磁响应速度PMSP的最直接策略。将Fe3O4纳米磁芯在磁性聚合物微球中的质量含量从17.4%增加到59.4%显著提高了磁响应速度(图3)；但难以解决悬浮稳定性的问题[41]。有报道用乳液聚合包埋方法制备了纳米磁芯含量高达70%的PMSP，但未提及如何进行表面修饰降低非特异吸附及保障悬浮稳定性[42-43]。因此，据各种性能要求综合考虑优化制备PMSP过程和成分组方，依然是严峻的技术挑战。

3 聚合成型和粒径：粒径和聚合成型的方式有关

制备PMSP主要用磁流体与单体分散后共聚合法，但不同聚合模式所得PMSP 粒径不同。乳液聚合所得PMSP粒径在0.05～0.5 μm，分散聚合所得PMSP粒径在0.5～10 μm，悬浮聚合所得PMSP粒径在100～1000μm，沉淀聚合所得PMSP粒径为mm级(图4)。制备PMSP也采用原位生成法，即先制备微球再在微球内部缝隙中原位沉淀生成磁性颗粒获得所需PMSP。

3.1 原位生成法

原位法又被称为浸渍法、渗磁法或化学转化法。该方法首先制得单分散的致密或多孔聚合物微球，此微球含有可与铁盐形成配位键或离子键的基团(如各种含NH2基团、环氧基、OH、COOH、SO3H等)，随后据聚合物微球所具有的不同功能基团以不同的方法来制备PMSP。上世纪80年代，Ugelstad等[44]用原位生成法合成了粒径从0.5到20 μm的 PMSP，聚合物微球中无机磁性组分到达30%，并用该方法开发了系列商品化PMSP，包括Thermo Fisher Scientific目前畅销的产品Dynabeads系列。

3.2 悬浮聚合法

溶有引发剂的单体以液滴状悬浮于溶剂中进行自由基聚合的方法称为悬浮聚合法。将水溶性单体的水溶液悬浮于油中，在引发剂的作用下进行聚合的方法，称为反相悬浮聚合法。通过一步悬浮聚合法，水为溶剂，聚乙烯醇-1788(PVA-1788)为分散剂，过氧化苯甲酰作为引发剂，苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯为单体，二乙烯苯作为交联剂，搅拌加热到80 ℃聚合2 h制备得到40 μm 左右的大粒径磁性微球[45]。

3.3 乳液聚合法

悬浮聚合法所得PMSP粒径分布宽，而乳液聚合法所得PMSP粒径分布窄。乳液聚合是在乳化剂的作用下借助机械搅拌，使单体在连续相中分散成乳状液，在乳液内聚合成形。通过反相微乳聚合法，以琥珀酸二辛酯磺酸钠(Aerosol OT，AOT)为乳化剂，聚乙二醇-1540-双马来酸单酯为单体，甲叉双丙烯酰胺为交联剂，过硫酸铵为引发剂，加热到37 ℃聚合8 h一步聚合制备得到400～800 nm的磁性微球[18]。用一步无皂乳液聚合技术，用丙烯酸钠为主要单体在磁流体存在下合成出表面含羧基、平均粒径接近80 nm的磁性复合微球[46]。用反相微乳聚合法制备了丙烯酰胺包覆的尺寸在80 nm左右的磁性复合微球，饱和磁化强度明显随磁性颗粒含量的升高而增大[47]。

3.4 分散聚合

分散聚合法合成大粒径、单分散性且粒径范围窄的PMSP有显著优势，且能方便引入PMSP表面的功能基。分散聚合是一种特殊的沉淀聚合，反应之前单体、溶剂、引发剂、分散剂等是一个分散均一的体系，反应开始以后，聚合物达到一定分子量后，从反应体系中沉淀出来。用高温分解法制备Fe3O4磁流体，表面改性剂12-羟基正十二烷酸对其进行表面修饰并分散在无水乙醇中；再通过一步分散聚合，选择乙醇/水(8∶2)作为溶剂，有机高分子聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，偶氮二异丁腈作为引发剂，苯乙烯为单体，机械搅拌加热到70 ℃聚合24 h制备得到1 μm到5 μm 的磁性微球[48]。

4 单分散性及悬浮稳定性

PMSP维持单分散状态时很稳定，而PMSP团聚后悬浮稳定性显著降低而易出现沉降；PMSP的单分散性及悬浮稳定性主要与粒径、密度和表面性质有关。Hirschein[49]定量描述了磁分离速度与外部磁场强度、PMSP比饱和磁化率及其粒径的关系，表明大粒径PMSP(>10μm)磁分离速度快，原因是粒径越大其包裹的磁性物质越多对应磁力越大，但所含磁性物质多则密度高而易自然沉降，即悬浮稳定性低。相反，小粒径磁性微球(<0.03 μm)通过振荡混匀就能够分散在溶液中而不沉降，但在分离时则需要很强磁场。因此，应据应用需求，综合考虑这两方面来选择磁性微球的粒径。

PMSP悬液有很强的浊度且能用可见光的吸收近似定量。PMSP颗粒发生聚集后很容易沉降，使得PMSP分散液的浊度显著降低；检测PMSP分散液浊度变化可方便地检测其悬浮稳定性。用此近似方法，发现Thermo Fisher Scientific的Dynabeads系列商品化磁珠在中性缓冲溶液中3.75 h自然沉降达到15% (图5)。已报道数据中，用亲水的聚乙二醇双顺丁烯二酸单酯为单体聚合包裹磁流体制备的PMSP在缓冲液中悬浮稳定性最好，10 h自然沉降比例仍然仅约15%，但其磁响应速度很慢[18](见图6)。

5 表面的高反应活性基团、对生物分子的固 定化容量

PMSP表面用于固定化生物分子的官能团可在有机单体和磁流体复合过程中引入，也可在制备PMSP后通过表面修饰生成。决定PMSP结合容量及固定化产物活性的因素包括：(1) 暴露在磁珠表面的活性官能团含量；(2) 官能团的活化方式；(3) 生物分子的固定化反应及条件；(4) 固定化生物分子和PMSP的间距，即是否有足够长的连接臂。

PMSP表面结合或固定化生物分子的容量受到很多因素的影响。非特异吸附固定化的蛋白容易失去活性，固定化的强度很低而容易丢失，故常需共价固定化。固定化蛋白的过程需在水溶液中进行，PMSP表面官能团的活化程度和反应活性，影响固定化容量和固定化蛋白的比活性。很多文献报道，PMSP表面固定化非特异性吸附能力很强的脂肪酶、血清清蛋白的最大容量可远远大于10 mg/g[50-52]，但固定化非特异吸附很弱的酶或蛋白时结合容量通常仅有1～3 mg/g[18,53](图7)。显然，只有保持固定化蛋白的比活性相对于游离状态无明显下降而显著增大固定化容量才有意义。

综上所述，为了同时满足应用对PMSP各项性能的要求，PMSP制备策略需系统性优化。限于PMSP的巨大商业价值，其制备的很多核心信息未曾公开，对探索更好的PMSP制备方法带来挑战。

PMSP目前应用最广的是在体外诊断行业(IVD)，在其细分领域分子诊断的核酸提取中和免疫诊断的磁分离全自动发光免疫检验中都是必需原材料。除此之外，在科研领域，比如细胞分选，免疫共沉淀，核酸提取等应用也非常广泛。由于所属行业的差距，对PMSP的要求也有所不同。目前国产磁珠基本能够满足科研领域研究的需要，甚至在IVD中分子诊断领域的核酸提取也能胜任；但是在要求灵敏度更高的磁分离全自动发光免疫检验中，国产磁珠能胜任的就寥寥无几。其主要原因在于，综述所提到的几个性能指标不能同时满足。

非特异性吸附决定磁珠的信噪比；磁响应速度决定磁珠的分离时间，这个也是决定单机测试数目的关键因素；悬浮稳定性决定反应的均一性，反应测试项目的重复性；结合容量决定单次需要磁珠的用量，反应的是单次测试磁珠的成本；结构稳定性决定的是磁珠的保质期；除此之外，客户最关心的是磁珠的批内和批间差，反应的是产品的稳定性，重复性。

目前国内全自动发光免疫检验所需微米磁珠市场超 2.0亿，但至今全部依赖进口，全球主要供应商依次是美国 Thermo Fisher Scientific(链亲和素磁珠和羧基磁珠)、日本 JSR (链亲和素磁珠)、德国 Merck(羧基磁珠)。中国和欧美日发达国家产生贸易争端造成发光免疫磁珠供应不稳定。所以，国内 IVD 行业虽已有较大规模但仍“缺芯少魂”；发光免疫磁珠作为 IVD 核心原料，实现其国产替代是我国 IVD 行业持续快速发展的必要前提。

由于国外技术垄断，要想实现技术突破，没有捷径，唯有积累更多的数据、明确各种性能的影响因素并综合考虑优化整体的制备策略，是最终获得满足应用要求的PMSP的必要途径。